粘紅酵母對獼猴桃貯藏期青霉病的抑制效果

雷 瓊，劉穎沙，李國秀

(楊凌職業技術學院，陜西 楊凌 712100)

獼猴桃具有豐富的營養價值和良好的藥用價值，其維生素C的含量遠遠超過柑橘、蘋果和梨，有VC之王的美稱[1]。進入21世紀以來，我國獼猴桃產業發展迅速，種植規模逐年增加，獼猴桃產量也隨之增加，獼猴桃采后在貯藏期出現的軟腐病問題也日益突出[2]。在陜西、四川、貴州和江西等省獼猴桃主要生產區，獼猴桃軟腐病發生普遍，平均發病率達20%～50%，造成嚴重的經濟損失[3]。段愛莉等[4]對陜西周至主栽獼猴桃品種貯藏期霉爛果實病原菌分離鑒定發現，其病原菌主要為青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、交鏈孢霉屬(Alternaria)、毛霉屬(Mucor)和擬青霉屬(Simplicillium)，其中青霉屬為優勢菌。不同的研究報道顯示，青霉病的病原菌種類不同，且優勢種類存在一定地域差異，對于青霉引起的腐爛病，其研究集中在室內藥劑篩選和田間藥效防治方面[3，5-6]。目前，關于獼猴桃貯藏期由青霉引起的腐爛病的藥效驗證及安全性檢測尚未有研究報道。青霉屬于真菌，真菌引起的獼猴桃采后及貯藏期病害的防治目前主要采用化學方法，但長期使用化學殺菌劑一方面會使病原菌產生抗性，另一方面化學殘留也威脅人類健康。隨著人們對食品安全和品質要求的提高，化學殺菌劑的使用也受到了限制[7]。粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)作為一種生物防治的拮抗菌，具有拮抗效果好，不產生毒素，可以和化學殺菌劑共同使用等特點，對梨、蘋果、桃及草莓等水果在采后貯藏期青霉菌引起的腐爛病具有明顯的防治效果[8]。陜西楊凌獼猴桃采后貯藏期的腐爛病主要由青霉菌引起，為研究粘紅酵母對獼猴桃青霉菌的控制效果，進行粘紅酵母對獼猴桃青霉菌的體外抑菌試驗和果實接種試驗，以期對陜西獼猴桃采后貯藏和保鮮提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 獼猴桃果實 以正常成熟的獼猴桃果實為試驗對象，品種為海沃德，購自陜西楊凌五泉鎮獼猴桃基地。選擇無機械損傷、無蟲傷、健康的獼猴桃果實，其大小、成熟度等外觀基本一致，分組待用。

1.1.2 試驗菌株 粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)由楊凌職業技術學院食品微生物實驗室提供；擴展青霉(Penicilliumexpansum)從腐爛的獼猴桃果實分離獲得，由楊凌職業技術學院植物病理實驗室提供。

1.1.3 試驗儀器 數顯恒溫振蕩培養箱(HZQ-F160)，臺式離心機(L550)，千分之一電子天平(AX223ZH/E)，隔水式恒溫培養箱(GHP-9160N)，高壓滅菌鍋(上海申安LDZX-30KBS)，移液器(100 μL)、血球計數板(25×16)，光學顯微鏡(奧林巴斯CX23)。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌制備 在 250 mL的三角瓶中裝入 50 mL的120Brix麥芽汁培養基，滅菌、接種，28℃、200 r/min振蕩培養20 h，3 000 r/min離心10 min收集菌體。血球計數板計數，調整其濃度，制成相應濃度的處理液。

1.2.2 病原菌孢子懸浮液制備 病原菌在PDA培養基上28℃培養7 d后，刮取適量孢子，轉移到無菌生理鹽水中，采用血球記數板計數，將其孢子濃度調至5×104個/mL。

1.2.3 粘紅酵母處理液制備 培養原液，將在麥芽汁培養基振蕩培養20 h的粘紅酵母培養液，用血球計數板調整其濃度為108CFU/mL；菌懸液，將上述培養原液離心后收集菌體，用無菌生理鹽水制成的菌懸液，其濃度為108CFU/mL；濾液為離心后的上清液。

1.2.4 粘紅酵母對青霉菌的體外抑菌試驗 取108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL和105CFU/mL粘紅酵母菌懸液、培養原液(108CFU/mL)、濾液(108CFU/mL)和無菌水各0.l mL，分別加至裝有5 mL PDB的無菌試管內，向各試管加入0.l mL濃度為5×104個/mL青霉菌孢子懸浮液。試驗共7個處理，2次重復。將所有試管置于28℃的振蕩培養搖床，80 min/r培養12 h，用普通光學顯微鏡和血球計數板分別測量各處理中青霉菌的孢子萌發率和芽管伸長長度。

1.2.5 不同處理粘紅酵母對青霉菌接種抑菌試驗 用70%酒精將獼猴桃果實浸泡40～50 s，無菌水沖洗果實2～3次，無菌濾紙吸干果實表面水分。用直徑9 mm的無菌打孔器在每個果實表面赤道部位對稱打2個孔，深度為3 mm。每孔加入30 μL粘紅酵母不同處理液(108CFU/mL培養原液，108CFU/mL菌懸液，108CFU/mL濾液，無菌水CK)，4 h后再在每孔口處加入15 μL青霉菌孢子懸浮液。用保鮮膜密封孔口，然后將所有果實置于保鮮盒中，在室溫條件(20℃)貯藏5 d。試驗共4個處理，每處理選擇5個果實，2次重復。5 d后取出果實，用游標卡尺測量果實的病斑直徑，計算發病率。

1.2.6 不同濃度粘紅酵母菌懸液對青霉菌接種抑菌試驗 將粘紅酵母的菌懸液的濃度分別調整為109CFU/mL、108CFU/mL和107CFU/mL、106CFU/mL，以無菌水作為對照，按照1.2.5的方法接種獼猴桃，考察不同濃度粘紅酵母菌懸液處理獼猴桃果實的病斑直徑和發病率。試驗共5個處理，每處理選擇5個果實，2次重復。5 d后取出果實，測量果實病斑直徑，計算發病率。

1.3 數據處理

采用Excel 2016和SPSS 25.0進行數據統計，SPSS 25.0對數據進行單因素方差分析，Duncan新復極差法檢驗顯著性。

2 結果與分析

2.1 粘紅酵母不同處理對青霉菌孢子萌發的抑制效果

從表1看出，粘紅酵母菌菌懸液在低濃度(105CFU/mL)時，對青霉菌孢子具有抑制作用，孢子萌發率為30%。當粘紅酵母菌懸液和培養液的濃度均為108CFU/mL，青霉菌孢子的萌發很低，分別為3%和5%，顯著低于濾液和對照；芽管的伸長長度也明顯低于濾液和對照。表明，粘紅酵母菌懸液和培養液均能在一定程度抑制青霉菌孢子的萌發，隨著粘紅酵母菌懸液濃度增大，孢子萌發率和芽管伸長長度均明顯降低；濾液和無菌水對青霉菌孢子均無抑制作用，芽管生長良好。

表1 粘紅酵母不同處理對青霉菌孢子萌發的體外抑制效果

Table 1 In vitro inhibition effect ofR.glutiniswith different concentration on spore germination ofPenicillium

處理Treatment孢子萌發率/%Spore germination rate芽管長度/μmGerm tube length粘紅酵母菌懸液 105CFU/mL 30.0 b23.3 c 105 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 106 CFU/mL 10.0 c16.4 c 106 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 107 CFU/mL 11.0 c9.3 c 107 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 108 CFU/mL 3.0 c8.4 c 108 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母培養液 108 CFU/mL5.0 c30.3 b 108 CFU/mL R. glutinis solution粘紅酵母濾液(108 CFU/mL)100.0 a50.8 b 108 CFU/mL R. glutinis filtrate無菌水(CK) Sterile water100.0 a65.0 a

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05.

2.2 粘紅酵母不同處理對青霉菌的接種抑菌效果

病原微生物主要以果實表面的傷口侵入，引起果實采后貯存期腐爛變質。有研究表明[9-10]，當果實表面存在傷口時，果實表面的拮抗酵母與病原菌在短時間內(24 h)產生營養和空間上的競爭關系，從而抑制病原菌生長。由圖1看出，獼猴桃采后接種青霉病菌，粘紅酵母不同處理對青霉病的防治效果不同。粘紅酵母菌懸液(108CFU/mL)抑制獼猴桃采后青霉病害的效果最佳，其發病率和病斑直徑分別為40%和3 cm，二者均大幅低于其他3種處理液(培養原液、濾液和無菌水)。濃度相同(108CFU/mL)條件下，培養原液抑菌效果低于菌懸液，其發病率和病斑直徑分別為50%和3.5 cm。用粘紅酵母濾液處理獼猴桃果實，加重病害發生，發病率高達100%。原因可能是濾液中存在某些營養物質利于青霉菌的生長。

2.3 不同濃度粘紅酵母菌懸浮液對青霉菌的抑菌效果

從表2看出，獼猴桃采后接種青霉菌，不同濃度粘紅酵母菌懸液對青霉病的防治效果存在差異。粘紅酵母菌懸液濃度越大，獼猴桃青霉病發病率和病斑直徑越小，抑菌效果越好。粘紅酵母菌懸液濃度為109CFU/mL時，發病率和病斑直徑分別為 6%和0.9 cm，顯著低于除108CFU/mL外的其余處理，幾乎完全控制青霉菌的發展。對照(無菌水)的發病率和病斑直徑分別為100%和3.4 cm。因此，在獼猴桃貯藏期間，綜合考慮經濟價值和抑菌效果，可選用108CFU/mL的粘紅酵母菌懸液來降低青霉病的發生，延長貯藏時間。

表2 不同濃度粘紅酵母菌懸液對青霉菌的抑菌效果

Table 2 Inhibition effect ofR.glutinissuspension with different concentration onPenicillium

處理Treatment發病率/%Morbidity病斑直徑/cm Disease spot diameter粘紅酵母菌懸液 106 CFU/mL 42.0 b2.8 b 106 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 107 CFU/mL 33.0 b2.1 b 107 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 108 CFU/mL 10.0 c1.1 c 108 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 109CFU/mL 6.0 c0.9 c 109 CFU/mL R. glutinis suspension無菌水(CK)Sterile water100.0 a3.4 a

3 結論與討論

粘紅酵母作為一種生防菌對多種水果采后引起的腐爛病具有較好的防治效果[8]，前人的研究多集中在蘋果、梨、草莓、甜櫻桃及柑橘等水果采后病害的研究。通過粘紅酵母不同濃度(108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL和105CFU/mL)和不同類型(培養原液、菌懸液、濾液)處理液進行青霉菌體外抑制試驗和獼猴桃果實青霉菌接種防治試驗，研究粘紅酵母對獼猴桃貯藏期由青霉菌引起的腐爛病的抑制效果，結果表明，粘紅酵母菌懸液、培養液均能在一定程度抑制青霉菌孢子的萌發，而濾液沒有抑制作用。在粘紅酵母不同處理液中，以粘紅酵母菌懸液處理的青霉菌抑菌效果最佳，當粘紅酵母菌懸液處理濃度為109CFU/mL時，獼猴桃果實在20℃的室溫條件貯藏，接種青霉病菌的果實發病率和病斑直徑分別為 6%和0.9cm，幾乎完全控制青霉菌的發展，但防治效果與粘紅酵母菌懸液108CFU/mL處理的差異不顯著。因此，在獼猴桃貯藏期間，綜合考慮經濟價值和抑菌效果，可選用108CFU/mL的粘紅酵母菌懸液來降低青霉病的發生，延長貯藏時間。

研究表明，采用粘紅酵母菌懸液處理獼猴桃果實，能一定程度抑制獼猴桃腐爛病發生，但獼猴桃的其他理化性質是否發生改變，需要進一步研究。因此，為了進一步提高粘紅酵母的抑菌效果，還需深入研究其抑菌機理。