貴州糯質高粱GBSSI基因型的鑒定

鄧小鋒，陳滿靜，曹紹書，譚金玉，陳柔屹，程 江，周棱波，鄭常祥

(1.貴州省農業科學院 旱糧研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農業科學院 農作物品種資源研究所，貴州 貴陽 550006)

高粱〔Sorghumbicolor(L.) Moench〕是世界第五大作物，種植面積僅次于小麥、玉米、水稻和大麥，廣泛用于飼料、糧食、釀造加工和能源等行業[1]。高粱籽粒營養成分豐富，其中含粗淀粉約75%，粗蛋白11%，脂肪3%，纖維2.5%～4%，與玉米飼用能效相當[2-3]。淀粉是植物光合產物碳水化合物的主要儲存形式。根據不同生物學功能，植物淀粉分為過渡型淀粉和貯藏型淀粉。過渡型淀粉白天在光合組織中積累，晚上降解后為植物生長代謝提供物質與能量[4]，貯藏型淀粉儲存于植物種子胚乳及塊莖中，為發芽和再生提供能量[5]。禾本科植物胚乳中的淀粉粒由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其合成和積累在造粉體中進行。右旋葡萄糖通過α-1,4糖苷鍵形成100～10 000個殘基的線性葡聚糖鏈，其上分布有極少量的α-1,6糖苷鍵，其多糖為直鏈淀粉。若在10 000～100 000個殘基的葡聚糖鏈上大量且規律分布著由α-1,6糖苷鍵形成的支鏈，其多糖為支鏈淀粉[6]。支鏈淀粉形成非定形晶狀體薄片結構，直鏈淀粉的線性支鏈分布于支鏈淀粉間，使淀粉粒呈半晶體狀[7]。

胚乳淀粉粒的合成是一個復雜而高度調控的過程，從1-磷酸葡萄糖進入造粉體后，至少涉及腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose Pyrophosphorylase，AGPase)、淀粉合成酶(Starch Synthase，SS)、淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme，SBE)和淀粉去分支酶(Starch Debranching Enzyme，DBE)4種酶的參與[6]。淀粉合成酶的功能是將底物腺苷二磷酸葡萄糖(Adenosine Diphosphate-glucose，ADPG)轉移到葡聚糖鏈的非還原端，使葡聚糖鏈不斷延伸。根據功能的不同又分為顆粒結合型淀粉合成酶(Granule-Bound Starch Synthase，GBSS)和可溶性淀粉合成酶(Soluble Starch Synthases，SS)[8]。顆粒結合型淀粉合成酶負責直鏈淀粉和支鏈淀粉特長鏈的合成，可溶性淀粉合成酶主要負責支鏈淀粉的合成。完整規則的高粱胚乳支鏈淀粉約占淀粉總量的70%～80%，直鏈淀粉約占總量的20%～30%[9-10]。

當高粱基因GBSS的功能缺失或者削弱后，籽粒胚乳呈糯質性狀，也叫蠟質性狀，胚乳中幾乎無法合成直鏈淀粉，全是支鏈淀粉。典型的糯質胚乳縱切面是灰白色的光滑面，如同蠟燭的蠟或白玉的表面。一些糯質高粱的整個胚乳區域都呈蠟質狀；一些糯質高粱的胚乳與胚的交界處有條狀白色粉質區，其他區域為蠟質狀；一些糯高粱胚乳中心有小的白色粉質區，周圍是蠟質性狀。由于形成蠟質性狀，GBSS在早期被命名為Wx基因(Waxy,Wx)[11]。典型的粳高粱籽粒整個胚乳區呈白色粉質的粗糙面。一些高粱材料的籽粒由于胚乳的淀粉粒與蛋白質基質結合緊密，在外周胚乳形成了晶體狀的角質[12]，角質性狀在谷類作物籽粒普遍存在[13]，隱性的wx基因存在劑量效應。

從多種谷類作物都發現糯質突變體。玉米的AC或DS轉座元件插入GBSSI基因中，使其不能正常翻譯，形成糯質性狀[14]。糯質水稻的GBSSI第一個內含子的5′剪接位點發生堿基突變，只能形成3.3 kb的未成熟mRNA，無法正常翻譯[15]。從云南的地方水稻品種中發現，GBSSI的497號堿基發生突變，使GBSSI與淀粉顆粒的結合度降低，形成另一類型的糯質性狀[16]。普通小麥含有3個GBSSI，分別為Wx-A1b，Wx-B1b和Wx-D1b。糯質小麥中，Wx-A1b編碼區完全缺失，Wx-B1b和Wx-D1b編碼區序列缺失一部分[17]。大麥中，GBSSI編碼區上游啟動子序列缺失降低了該基因的轉錄效率，同時GBSSI編碼區的1個堿基錯義突變，改變了該酶的保守結構域，使GBSSI完全失去功能[18]。

已知高粱的GBSSI有4種突變基因型。wxa的第3外顯子處插入了約4kb的轉座序列，wxb的一個堿基C突變為T，保守結構域的谷氨酸轉變為組氨酸，使GBSSI活性降低[19]。wxa不能翻譯成酶GBSSI，胚乳完全不能合成直鏈淀粉。wxb的GBSSI酶活性只有正常的75%。四川糯高粱分析鑒定出基因型wxc和wxd[20]。兩者由于在第9外顯子和第11外顯子剪接處發生堿基缺失或者突變，造成編碼框改變，翻譯后的酶缺乏正常的功能。貴州糯高粱的wx基因型的分析研究已有報道[21]，但其針對的是糯高粱品種，且數量非常少。鮮見關于貴州省糯高粱基礎資源鑒定的相關研究報道。為此，對前期工作中已經搜集的一批貴州地方高粱資源(包括地方種、農家種和野生高粱)進行糯質高粱的wx基因型鑒定，以期為貴州地方高粱資源在育種中應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

高粱材料：用于糯質分析的高粱材料(貴州地方種、農家種和野生高粱)共計252份，前期工作中搜集。其中，貴州省資源226份，省外資源20份，育種中間材料5份，貴州地方品種1份。

1.2 方法

1.2.1 胚乳性狀的鑒定 收集的基礎資源中，許多材料的wx等位基因為雜合狀態，包括不同基因型及某種基因型在胚乳的不同拷貝數。通過快速鑒定籽粒胚乳的剖面性狀來確定糯質材料。每份材料隨機選8～10顆飽滿籽粒，經縱切后進行剖面觀察鑒定，不同胚乳性狀分別用數字1、2、3和4進行標識。

數字1：籽粒整個胚乳區呈灰白色不透明蠟質狀；胚乳與胚的交界處有細小條狀粉質區，其余區域為蠟質狀；胚乳中心有細小的白色粉質區，周圍是蠟質狀；整個胚乳區呈更白的不透明蠟質狀。

數字2：從胚至種子頂端有一條白色粉質區域，該區域最多約占胚乳面積的1/2，其余部分呈蠟質狀。若某材料的4～5顆籽粒呈前述蠟質胚乳，該材料將用于基因型鑒定。材料角質性狀通過觀察相同縱切剖面進行鑒定，并記載角質占剖面的面積。

數字3：角質胚乳。

數字4：完全粉質胚乳。

1.2.2 DNA提取 共鑒定出121份糯質胚乳材料，其中100份材料用于后續wx基因型鑒定，2份角質胚乳材料作為對照。100份材料中包括基礎材料94份，中間材料5份，貴州品種紅纓子作為比較材料。每份材料約20粒種子播于發苗盤，各材料在3葉期時取5～8個單株的葉片進行混合。DNA提取采用改良CTAB法：約0.2 g混合葉片，放入1.5 mL PE離心管，加入液氮，用轉槍研磨成粉末。每管加入預熱的提取緩沖液500 μL，在65℃溫浴1 h，每間隔10 min溫和混勻1次。以10 000 r/min離心5 min，轉移上清液至新離心管。每管加入8 μL的RNAse A(10 mg/mL)，37℃溫浴20 min。短暫離心，加入500 μL氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，輕輕顛倒混勻10～15 min，直到混液呈白色乳濁狀。12 000 r/min離心10 min，轉移上清液至新離心管，再加入500 μL的氯仿∶異戊醇混合液，重復以上操作1次。沉淀DNA時，加入適量5 M/L NaAc溶液，混勻后加入2倍體積4℃預冷的95%乙醇溶液，-20℃放置1 h，于低溫10 000 r/min離心10 min，吸出上液，加入預冷的75%乙醇洗滌，10 000 r/min離心5 min，吸出上液。再重復洗滌1次。10 000 r/min離心1 min后，吸出殘留乙醇，敞開管蓋置于干凈環境10～15 min，隨后每管加入100 μL ddH2O，DNA充分溶解后，用微量分光光度計和瓊脂糖電泳檢測DNA的濃度和質量。緩沖液提取：100 mM Tris-HCL(pH 7.5)，25 mM EDTA，1.5 M NaCl，2%(w/v)CTAB。0.3%(v/v)β-mercaptoethanol，在緩沖液預熱前加入。

1.2.3wxa基因型的檢測 參照文獻[19]的方法合成引物，引物序列(5′～3′)：Wxa-F，CGTGGCGAGATCAAACTCTA;Wx-F,GGCCTGGATTCAATGTTCTT；Wx-R，CTGGTTGTCCTTGTAGTCCGTT； PCR體系共25 μL：ddH2O 13.25 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 0.75 μL，DNA 2 μL，Pfu酶0.5 μL。 PCR程序：98℃預熱1 min，98℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 1 min 2 s，共計35個循環，4℃冷置。產物于2%瓊脂糖凝膠中120 V電泳，凝膠成像系統拍照，標記Marker為 Marker J。

1.2.4 檢測wxb基因型 根據Sattler方法合成引物[19]，引物序列(5′～3′)：Wxb-F，CGACCGTGTGTTCATTGACCAC；Wxb-R TTGTTCAGTGCCTTTGCCTCG。PCR體系共25 μL：ddH2O 14 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 3 μL，Pfu酶0.5 μL。PCR程序：98℃預熱1 min，98℃ 30 s，54.6℃ 30 s，72℃ 2 min 34 s，共計40個循環，4℃冷置。標記Marker為 Marker J。

1.2.5 檢測wxc基因型 參照文獻[20]的方法進行改動，為提高PCR擴增效率，重新設計引物。引物序列(5′～3′)：Wxc-F，TCGTCAACGGCATGGACGTCAGCGAG；Wxc-R，GCCGGCCATGATGTGGTGTGCCAG。PCR體系共25 μL：ddH2O 14 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 3 μL，Pfu酶0.5 μL。PCR程序：98℃預熱1 min，98℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 1 min 4 s，共計35個循環，4℃冷置。PCR產物酶切反應體系 20 μL：ddH2O，13.5 μL，10×buffer B 2 μL，PCR DNA 4 μL，HphI 5 U。37℃溫浴16 h，于3%瓊脂糖凝膠中120V電泳1 h，凝膠成像系統拍照。標記Marker為 Marker J。

1.2.6 檢測wxd基因型 參照文獻[20]的方法進行改動，為提高PCR擴增效率，重新設計了PCR引物。引物序列(5′～3′)：Wxd-F，CGCTGCTCATGGAGGAGGACATACAGATCGTT,Wxd-R,AGGGCTCGAAGCGGCTGGTGACGG。PCR體系共25 μL：ddH2O 14 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 3 μL，Pfu酶0.5 μL。PCR程序：98℃預熱1 min，98℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 33s，共計35個循環，4℃冷置。PCR產物酶切反應體系 20 μL：ddH2O 11.5 μL，10×buffer SduI 2 μL，PCR DNA 6 μL，SduI 5 U。酶切在37℃溫浴16 h，于3%的瓊脂糖凝膠中120 V電泳1 h，凝膠成像系統拍照。標記Marker為 Marker A。

2 結果與分析

2.1 102份高粱材料的胚乳性狀

標記為1的材料蠟質化程度高于標記為2的材料，3為角質籽粒，4為粉質籽粒。從表1可知，D58和E48(對照)籽粒的剖面性狀分別為3(4/5)和3(5/6)。其余100份高粱材料中，籽粒剖面性狀標記為1的有D1、E3和E40等11個材料，標記為2的有A5、B19和B37等45個材料，標記為2、1或1、2的有B11、B45和C20等30個材料，標記為2、1、3或3、1、2的有D91和E52，標記為1、2、4或2、4、1的有E26、A13和F19等5個材料，標記為2、4的有F29，標記為3、2或2、3的有A25、F40和F13等4個材料。可見，許多糯質高粱材料之間籽粒蠟質化程度及多份材料內部的籽粒蠟質化程度均不同，揭示許多材料含有雜合的wx基因型，還含有野生型Wx，同時許多材料籽粒間糯質基因型的拷貝數不同，形成了籽粒蠟質化程度的多樣性。

表1 102份高粱材料籽粒的胚乳性狀

注：從鑒定的糯質胚乳材料中選擇100份進行wx基因型分析，角質胚乳材料D58和E48為對照；括號內數據表示角質占剖面的面積。

Note:wxgenotype of 100 accessions selected from indentified glutinous endosperm accessions is analyzed. D58 and E48 of keratin endosperm are as the control. The data in bracket means the area of keratin in section.

2.2 不同基因型的檢測

2.2.1wxa基因 在102份材料中，若PCR產物含611 bp條帶即為wxa基因型，含519 bp條帶為非wxa基因型。從圖1看出，基因型為純合wxa的材料有68份，基因型為非wxa的材料有23份，含有雙帶基因型的雜合材料有11份。23份非wxa材料和11份含有雙帶基因型的雜合材料共計34份材料用于后續wxb、wxc基因型的檢測。

注：M為Marker(下同)；D85鑒定2次。

Note:M, Marker (the same below); D85 tested twice.

圖1 102份材料wxa基因型的檢測結果

Fig.1 Detection result ofwxagenotype in 102 accessions

2.2.2wxb基因型 從圖2看出，在14份材料中，擴增產物中包含1 282 bp的目標條帶，但也包含約350 bp的雜帶1條，且雜帶的亮度高于目標條帶。因此，Sattler方法的引物無法用于檢測14份高粱材料的wxb基因型，需要重新設計特異性引物。

2.2.3wxc基因型 若PCR產物為529 bp單條帶即為wxc基因型。產物被HphI酶切為452 bp和77 bp的材料為非wxc基因型。從圖3可知，基因型為純合wxc的材料有8份，基因型為非wxc的材料有11份，含有3條條帶的雜合材料基因型有15份。結合wxa基因型的檢測結果，11份非wxc材料中，同時含有wxa基因型和未鑒定基因型的材料為B46、C17和E52，其他8份材料的基因型為非wxa和非wxc。15份雜合材料中，B19等7個材料不含wxa，除含有wxc外，還含有野生型或未鑒定的基因型。B30等8個材料含有wxa和wxc，但可能還含有野生型等其他基因型。15份雜合材料和11份非wxc材料用于后續wxd基因型的檢測。

2.2.4wxd基因型wxd基因型檢測中，若PCR產物不能被SduI酶切為269 bp單條帶的材料為wxd基因型，產物被酶切為148 bp、115 bp和6 bp的材料為非wxd基因型，6 bp片段由于長度短，電泳過程中析出凝膠外，在檢測時不可見。含有3條條帶的材料為雜合型。從圖4看出，基因型為純合wxd的材料有6份，基因型為非wxd的材料有18份，基因型為wxd和其他基因型的雜合材料有2份。結合材料wxa和wxc基因型的檢測結果，確定雜合材料B19含wxc和wxd基因型，B46含wxa和wxd基因型。非wxd的18份材料中，B30、D86、E9、II137、E7、F31和E40是wxa和wxc基因型；B17除含wxa和wxc基因型外，可能還含有野生型等其他基因型；C17和E52含wxa和野生型等其他基因型；B45、A25、F29、C27、F19和F15含wxc和野生型等其他基因型；D58和E48不含wxa、wxc及wxd基因型。

3 結論與討論

研究結果表明，100份糯質材料通過wxa、wxc和wxd基因型的檢測，GBSSI位點為純合wxa的材料有68份，純合wxc的材料有8份，純合wxd的材料有6份；位點包含2種糯質基因型的材料有9份。其余9份材料中，8份材料除含1種糯質基因型外，還含有野生型等未鑒定基因型；1份材料除2種糯質基因型外，可能還含有野生型等未鑒定的基因型。D58和E48不含wxa、wxc及wxd基因型。研究發現，wxb鑒定方法不成熟，未進行wxb的鑒定。

研究結合籽粒剖面蠟質鑒定方法和3種wx基因型分子鑒定方法，在不測量籽粒支鏈淀粉含量的前提下，快速分析高粱糯質資源的wx基因型，為后續研究和應用提供有用信息。研究同時發現，部分材料的籽粒剖面鑒定結果與分子鑒定結果間有偏差。如PCR鑒定出純合wxa的材料68份，無Wx野生型，但在籽粒剖面性狀鑒定中，B5和B41等部分材料的蠟質標識為2，即在檢測的8粒籽粒中，縱切剖面胚乳區域含有1條白色粉質區。預示這些材料除含wxa外，還含Wx野生型。推測偏差原因：一是進行剖面蠟質性狀鑒定和PCR分子鑒定的籽粒為同1份材料的不同籽粒。研究中的糯質高粱來自農家種和地方栽培種等，同1份材料的不同籽粒間糯質性狀有差異。二是部分糯質材料的Wx野生型量遠少于wxa基因型量，由于PCR過程中 3種引物添加到同一反應體系中，Wx野生型模板無法擴增出足夠的量顯示出來。在后續試驗中，一是改縱切為橫切，完成籽粒剖面性狀的鑒定后，將含有胚的部分進行發芽，其DNA用于分子鑒定，性狀鑒定和分子鑒定的結果將更一致。二是在wxa基因型檢測中，2種反向引物分別添加到不同PCR體系，通過擴增微量模板，提高鑒定的靈敏度。

在后續研究中，需進一步鑒定4種wx糯質基因型籽粒中不同wx基因拷貝數下籽粒剖面的性狀差異。wxa基因型無法合成有活性的GBSSI酶，wxb合成的酶活性約為野生型的20%，未見wxc和wxdGBSSI酶活性的研究報道[19]。4種wx基因型間及同種wx基因型的不同拷貝數間，籽粒剖面性狀、支鏈淀粉含量均存在差異。鑒定wxb基因型時發現，SATTLER等[19]報道的引物特異性不高。因此，需要重新設計特異引物。研究反映出搜集的高粱糯質資源材料的等位基因較豐富，在后續繁種保存過程中，需多株繁種，防止有益等位基因的丟失。