骨碎補及其主要成分對小鼠子宮內膜同源盒基因10 mRNA、白血病抑制因子和整合素α_νβ₃的影響

石玥 劉雁峰 穆國華 王鐵楓 姜晶 何波琳 喬婷 王佳楣

摘要 目的：探索骨碎補及其主要成分對胚泡著床障礙模型小鼠子宮內膜的影響。方法：實驗動物分為7組：空白組、模型組、西藥組I（補佳樂組）、西藥組II（阿司匹林組）、骨碎補組、骨碎補總黃酮組、骨碎補柚皮苷組，以GnRHa+HMG+HCG方法造模，干預后檢測各組相關指標的表達量。結果：骨碎補組及總黃酮組小鼠子宮內膜同源盒基因10（HOXA-10）mRNA表達明顯增加（P<0.05）;骨碎補組、總黃酮組及柚皮苷組白血病抑制因子（LIF）表達明顯增加（P<0.05）;骨碎補組整合素ανβ3表達明顯增加（P<0.05），總黃酮組差異無統計學意義（P>0.05），但積分光密度值明顯增加（P<0.05）。結論：骨碎補可能通過調節胚泡著床期子宮內膜HOXA 10、LIF、整合素ανβ3的表達，有利于胚泡對子宮內膜的黏附，從而改善子宮內膜容受性。總黃酮作為骨碎補藥材的主要活性成分，亦可改善子宮內膜容受性。

關鍵詞 骨碎補;總黃酮;柚皮苷;子宮內膜容受性;同源盒基因A10;白血病抑制因子;整合素ανβ3

Effect of Rhizoma Drynariae and Its Main Component on HOXA-10 mRNA，LIF and Integrin ανβ3 Expression in Mice Endometrium

SHI Yue1，LIU Yanfeng2，MU Guohua2，WANG Tiefeng2，JIANG Jing1，HE Bolin1，QIAO Ting1，WANG Jiamei1

（1 Haidian Maternal & Child Health Hospital，Beijing 100080，China; 2 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100010，China）

Abstract Objective：To observe effects of rhizoma drynariae and its main components on endometrium of mice with blastocyst implantation disorder.Methods：Divide the experimental animals into 7 groups：a blank group，a model group，a western medicine treated group 1 （progynova group），a western medicine treated group 2 （aspirin group），a rhizoma drynariae group，an osteopractic total flavone group and a rhizoma drynariae naringin group.Mice model with GnRHa+HMG+HCG was established.We administrated drugs and tested the expression amount of each index in mice endometrium.Results：Expression of HOXA-10 mRNA in mice endometrium of rhizoma drynariae group and total flavone group increased significantly （P<0.05）.Rhizoma drynariae group，total flavone group and naringin group had increased LIF expression in mice endometrium （P<0.05）.Rhizoma drynariae group had an increased integrin ανβ3 expression in mice endometrium （P<0.05），there was no significant difference in total flavone group （P>0.05），but the integral optical density was significantly increased （P<0.05）.Conclusion：Rhizoma drynariae may regulate the expression of HOXA-10，LIF and integrin ανβ3 in endometrium during embryo implantation，which is conducive to the adhesion of blastocyst to endometrium，in order to improve endometrial receptivity.As the main active component of rhizoma drynariae，total flavonoids can also improve endometrial receptivity.

Keywords Rhizoma drynariael; Total flavone; Naringin; Endometrial receptivity; Homeobox A10; Leukaemia inhibitory factor; Integrin ανβ3

中圖分類號：R285.5;R271.41;R733.7文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.007

骨碎補本是著名的骨傷科常用中藥，因其補腎氣，行血脈，益筋骨，為名老中醫肖承悰教授治療子宮內膜容受性低的經驗方——二補助育湯的君藥之一。子宮內膜容受性與體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的成功與否具有較高相關性，通過中藥來提高子宮內膜容受性逐漸成為被認可的治療手段。針對二補助育湯開展的臨床及實驗研究取得了較好的研究結果[1-6]，但關于該方的生物活性及其影響子宮內膜容受性的確切作用機制仍在探索階段，中藥單體對藥物機制探討更有針對性。

骨碎補有補腎活血功用，骨碎補黃酮類化合物是其主要活性成分，柚皮苷為主要鑒定標準。故本實驗選用骨碎補及其主要成分總黃酮、柚皮苷作為干預，以同源盒基因A10（Homobox Gene，HOX）、白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）以及整合素ανβ3等影響子宮內膜容受性的公認指標開展研究，初步確定骨碎補影響子宮內膜容受性的主要活性成分及作用機制，為后續相關研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用SPF級ICR小鼠（北京維通利華實驗技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2012-0001），8～12周齡，體質量（25±2）g。對全部小鼠進行陰道涂片，檢查動情周期，連續觀察2個動情周期正常者。

1.1.2 藥物

1）骨碎補：顆粒劑30 g、骨碎補總黃酮（強骨膠囊）（北京岐黃醫藥股份有限公司，國藥準字Z20030007），購自北京中醫藥大學東直門醫院藥房;柚皮苷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：N1007345），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2）GnRHa{醋酸曲普瑞林注射液，達必佳[輝凌制藥（Ferring GmbH），德國，進口批號H20100365]};注射用尿促性素（HMG，國藥準字H20033108）;注射用絨促性素（HCG，國藥準字H44020674）。以上藥品均購自北京婦產醫院。

3）戊酸雌二醇（補佳樂，法國DELPHARM Lille股份有限公司，進口批號：H20120368）;阿司匹林腸溶片（Bayer股份有限公司，國藥準字J20130078）。以上藥品均購自北京中醫藥大學東直門醫院。

1.1.3 試劑 抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE，Dako Denmark A/S，貨號K5007;LIF（稀釋比1∶100;Novus，貨號：NBP2-27406）;整合素ανβ3（稀釋比1∶100;Abbiotec，貨號：251672）;引物序列及其內參磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）序列。見表1。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將實驗動物分成7組，即：空白組、模型組、骨碎補組、骨碎補總黃酮組、柚皮苷組、西藥組I（補佳樂組）、西藥組II（阿司匹林組）。每組有小鼠10只。

造模方法：GnRHa+HMG+HCG。模型組，西藥組I（補佳樂組），西藥組II（阿司匹林組）、骨碎補組、骨碎補總黃酮組、骨碎補柚皮苷組，觀察上述各組小鼠陰道涂片，以動情日為第1天，于每天上午9：00定時腹腔內注射達必佳（GnRHa）40? IU/100 g體質量，連續9 d，至第9天同時注射尿促性素（HMG）1 U/100 g體質量，48 h后注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）10 IU/100 g體質量，造成胚泡著床障礙模型。

1.2.2 給藥方法 于造模同步為空白組和模型組小鼠每天灌服生理鹽水0.2 mL，每日骨碎補組按0.03 g/20 g體質量、骨碎補總黃酮組按0.02 g/20 g體質量、骨碎補柚皮苷組按0.01 g/20 g體質量的各自相應濃度灌服（骨碎補以前期工作中取全方的中劑量，相當于臨床成人劑量140 g/60 kg體質量，總黃酮及柚皮苷劑量以其在相關實驗研究關報道的有效劑量范圍取中值[7-8]），西藥組I每日灌服補佳樂6 μg/20 g體質量（相當于臨床體質量60 kg的成人劑量2 mg/60 kg），西藥組II每日灌服阿司匹林225 μg/20 g體質量（相當于臨床體質量60 kg的成人劑量75 mg/60 kg），連續10 d。

1.2.3 取材 在第11天處死小鼠（斷頸），取各組小鼠子宮，一角迅速放入液氮，以qPCR對各組小鼠子宮內膜檢測HOXA-10 mRNA的表達;另一角則于4%多聚甲醛中固定，以免疫組化HRP法，對各組小鼠子宮內膜測定LIF、整合素ανβ3的表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。各組間比較采用單因素ANOVA。相對定量2-△△CT法分析計算各個樣本目的基因的表達。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠子宮內膜HOXA-10 mRNA表達情況

2.1.1 HOXA-10擴增曲線和溶解曲線 從圖1和圖2可以看出，各反應管的擴增效率相近，且未見非特異性擴增。

2.1.2 各組小鼠子宮內膜HOXA-10 mRNA表達情況 各組正態性檢驗P均大于0.10，均為正態（見表2）。方差齊性檢驗P=0.03<0.05，各組方差不齊，取Welch檢驗F′=6.603，P=0.011，P<0.05，各組間比較差異有統計學意義。多重比較后，模型組表達明顯低于空白組（P=0.010）;與模型組比較，骨碎補組及總黃酮組小鼠子宮內膜HOXA-10 mRNA表達明顯增加（與骨碎補組P=0.008，與總黃酮組P=0.009，P<0.05），與柚皮苷組差異無統計學意義;與西藥組比較，骨碎補組、總黃酮組與補佳樂組差異無統計學意義（與骨碎補組P=0.218，與總黃酮組P=0.245，P>0.05），柚皮苷組與阿司匹林組差異無統計學意義（P=0.519>0.05）。

2.2 各組小鼠子宮內膜LIF表達情況

2.2.1 顯微鏡100倍觀察到LIF在各組小鼠子宮內膜的表達 見圖3。

2.2.2 各組小鼠子宮內膜LIF表達情況 在LIF表達中，各組正態性檢驗P均大于0.10，均為正態。方差齊性檢驗P=0.260>0.05，各組方差齊。ANOVA檢驗F=95.217，P=0.000，P<0.05，各組間比較差異有統計學意義。多重比較后，模型組小鼠子宮內膜LIF表達明顯低于空白組（P=0.000）;與模型組比較，骨碎補組、總黃酮組及柚皮苷組小鼠子宮內膜LIF表達明顯增加（P均等于0.000，P<0.05）;與西藥組比較，骨碎補組子宮內膜LIF表達與阿司匹林組差異無統計學意義（P=0.488，P>0.05），但低于補佳樂組（P=0.006，P<0.05）;總黃酮組與骨碎補組比較差異無統計學意義（P=0.084，P>0.05）。

2.3 各組小鼠子宮內膜整合素ανβ3表達情況

2.3.1 顯微鏡200倍觀察到整合素ανβ3在各組小鼠子宮內膜的表達 見圖4。

2.3.2 各組小鼠子宮內膜整合素ανβ3表達情況?? 模型組小鼠子宮內膜整合素ανβ3表達明顯低于空白組（t=-7.355，P=0.000）;與模型組比較，骨碎補組小鼠子宮內膜整合素ανβ3表達明顯增加（t=2.684，P=0.017，P<0.05），而總黃酮組及柚皮苷組差異無統計學意義（P>0.05，分別為t=-1.775，P=0.095，t=1.651，P=0.119）;骨碎補組與西藥組比較，差異無統計學意義（骨碎補與補佳樂t=-1.781，P=0.093>0.05，骨碎補與阿司匹林t=-1.321，P=0.205>0.05）。見表4。

在小鼠子宮內膜整合素ανβ3表達面積的對比中，總黃酮組及柚皮苷組與模型組比較差異均無統計學意義，所以針對小鼠子宮內膜整合素ανβ3表達的積分光密度值（OD值），做進一步比較。與模型組比較，總黃酮組OD值明顯增加（P<0.05），柚皮苷組差異無統計學意義。見表5。

3 討論

3.1 HOXA10、LIF及整合素ανβ3與子宮內膜容受性的關系 因本研究以單味藥及其成分作為干預手段，實驗結果不如全方，而且側重于活性成分的初步探索，而并非子宮內膜容受性的調節機制的因素探究，所以選用目前公認的、可視為標志性、并非探索性的指標進行研究，即HOXA 10、LIF和整合素ανβ3。

HOXA10的表達已被普遍認為與子宮內膜容受性具有密切關系，其以調節因子的身份在胞飲突形成、子宮內膜容受性和胚胎植入等的建立過程中必不可少[9]。

LIF在胚胎移植中的子宮轉變為接受狀態、蛻膜化、胚泡生長、胚胎-子宮內膜相互作用，以及免疫調制等諸多過程中均發揮重要的作用[10]，LIF被認為是種植著床預測的金標準。

整合素ανβ3表達于子宮內膜腺上皮的時間與植入窗期一致，子宮內膜中低水平的整合素ανβ3與子宮內膜容受性下降有關[11]，其作為細胞黏附分子，是衡量子宮內膜容受性的一個公認指標。

3.2 骨碎補及其主要成分與子宮內膜容受性的關系 骨碎補原本是著名的一味骨傷科常用中藥，性味苦、溫，入肝、腎經，功用補腎、活血，主治腎虛腰痛、跌打閃挫、骨傷、風濕痹痛。二補助育湯為肖承悰教授治療子宮內膜容受性低的經驗方，骨碎補就作為其君藥之一。全方補腎氣，通胞脈，臨床應用取得良好療效[2-3]。

骨碎補的相關研究多集中于總黃酮和柚皮苷[7-8，12-14]。黃酮類化合物是骨碎補藥材的主要活性成分[12]。骨碎補總黃酮為天然的植物雌激素源，如強骨膠囊，即是以其為有效成分開發的藥品。在鑒定方面，除形態特征外，中藥骨碎補的鑒定標準多參照柚皮苷的含量。骨碎補中的柚皮苷是其中重要的二氫黃酮類化合物，能夠發揮多種藥理活性作用，如成骨細胞誘導、抗過敏、抗病毒、抗氧化等[12]。在現代藥理學研究中，柚皮苷具有顯著的植物雌激素作用[15]。

本實驗結果顯示，骨碎補組及總黃酮組小鼠子宮內膜HOXA-10 mRNA表達明顯增加，柚皮苷組與西藥組差異無統計學意義;LIF表達方面，骨碎補組、總黃酮組及柚皮苷組均明顯增加;整合素ανβ3，骨碎補組能明顯提高表達，與西藥組差異無統計學意義，總黃酮能明顯提高OD值，使內膜光密度增加，柚皮苷差異無統計學意義。

故我們推測，骨碎補改善子宮內膜容受性的作用機制為上調HOXA-10 mRNA、LIF及整合素ανβ3的表達。總黃酮作為骨碎補藥材的主要活性成分，亦可改善子宮內膜容受性，而作為鑒定主要成分的柚皮苷，可能因為劑量問題，在此實驗中體現的療效有限。

關于骨碎補對子宮內膜容受性直接影響，目前尚未有相關報道，骨碎補在婦科方面最多見于婦女骨質疏松的研究，所以沒有在子宮內膜容受性方面可行的骨碎補有效成分及用量可參考。本實驗初步探索，為此提供了依據，今后可將骨碎補有效成分細化，并設立梯度，開展進一步研究。

參考文獻

[1]梁嘉玲，劉雁峰，申萌萌，等.二補助育湯對胚胎著床障礙模型小鼠子宮內膜自噬基因Beclin-1、LC3B表達的影響[J].北京中醫藥大學學報，2019，42（11）：910-915.

[2]石玥，劉雁峰，穆國華，等.二補助育改良方對反復體外受精-胚胎移植失敗患者子宮內膜容受性的影響[J].世界中醫藥，2019，14（9）：2514-2518.

[3]申萌萌，劉雁峰，梁嘉玲，等.二補助育湯對反復體外受精-胚胎移植失敗患者子宮內膜超聲學指標的影響[J].北京中醫藥大學學報，2019，42（2）：167-170.

[4]申萌萌，劉雁峰，趙青竹，等.二補助育湯對胚胎著床障礙小鼠子宮內膜胞飲突及環氧合酶-2表達的影響[J].中華中醫藥雜志，2018，33（5）：2065-2069.

[5]石玥，吳麗婷，穆國華，等.二補助育湯及改良方對小鼠子宮內膜整合素ανβ3、SCF mRNA及HOXA-10 mRNA表達的影響[J].中華中醫藥雜志，2017，32（5）：1997-2000.

[6]石玥，穆國華，吳麗婷，等.二補助育改良方對小鼠子宮內膜胞飲突、LIF、ER和PR表達的影響[J].環球中醫藥，2017，10（4）：425-429.

[7]李建國，謝興文，李晶，等.骨碎補總黃酮防治原發性骨質疏松癥的研究進展[J].生命的化學，2019，39（2）：229-233.

[8]張樂其，柳毅，徐高麗，等.中藥柚皮苷誘導成骨作用的研究進展[J].口腔醫學，2016，36（3）：277-280.

[9]Bagot CN，Kliman HJ，Taylor HS.Maternal Hoxa10 is required for pinopod formation in the development of mouse uterine receptivity to embryo implantation[J].Dev Dyn，2001，222（3）：538-544.

[10]Salleh N，Giribabu N.Leukemia inhibitory factor：roles in embryo implantation and in nonhormonal contraception[J].Scientific World Journal，2014，2014：201514.

[11]Tan G，Guo W，Zhang B，etc.Temporary reduction and slow recovery of integrin ανβ3 in endometrium after uterine arterial embolization[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.2012，160（1）：66-70.

[12]錢茜.骨碎補化學成分和藥理作用研究進展[J].中國生化藥物雜志，2015，35（3）：186-188.

[13]封傳華，李剛，張靜，等.燙骨碎補中總黃酮及柚皮苷的含量測定[J].中國藥業，2016，25（1）：63-65.

[14]張新濤，江華基，梁祖儒，等.骨碎補總黃酮通過激活mTOR信號通路促進大鼠腱骨愈合的實驗研究[J].中國骨傷，2018，31（3）：248-253.

[15]楊利娟，黃君梅，王飛.何首烏、骨碎補和淫羊藿的植物雌激素作用研究[J].中藥與臨床，2012，3（13）：37-40.

（2020-03-24收稿 責任編輯：蒼寧）

基金項目：國家自然科學基金項目（81473721）;國家中醫藥管理局全國名老中醫肖承悰教授學術經驗研究及傳承工作室作者簡介：石玥（1988.02—），女，博士，醫師，研究方向：中醫婦科，E-mail：october5845@163.com通信作者：劉雁峰（1963.02—），女，博士，主任醫師，博士研究生導師，研究方向：中醫婦科，Tel：（010）84013157，E-mail：liuyaf8888@sina.com