可注射載Co/Fe/Cu透鈣磷石的制備及其抗菌性能

張開(kāi)麗，裴正軍，李光大，李曉玉，趙三團(tuán)，米镠洋

(1. 河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室， 北京 100038；3. 河南科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

0 引 言

磷酸鈣材料因具有與骨相似的無(wú)機(jī)成分，被廣泛應(yīng)用于骨修復(fù)領(lǐng)域[1-2]。可注射磷酸鈣陶瓷(磷酸鈣骨水泥)因?yàn)槠淅趯?shí)現(xiàn)微創(chuàng)且固化前可任意賦形更方便操[3]，廣受臨床醫(yī)生歡迎。在眾多的可注射磷酸鈣骨水泥中，透鈣磷石骨水泥因?yàn)榫哂辛己玫纳锵嗳菪裕铱稍隗w內(nèi)完全降解而備受關(guān)注[4-5]。

但透鈣磷石本身也存在一些缺點(diǎn)，比如本身不具備抗菌性能。眾所周知，細(xì)菌可以吸附并生長(zhǎng)在磷酸鈣植入物表面，導(dǎo)致嚴(yán)重感染[6]。雖然可以使用抗生素進(jìn)行治療，但抗生素價(jià)格昂貴，而且過(guò)多使用抗生素會(huì)使病原體對(duì)抗生素治療的免疫力上升，甚至?xí)?dǎo)致超級(jí)細(xì)菌出現(xiàn)[7]。當(dāng)前，在磷酸鈣材料上負(fù)載具有重要生理意義同時(shí)又具有抗菌性能的陽(yáng)離子，使材料抗細(xì)菌感染以克服在骨移植過(guò)程中過(guò)多使用抗生素，成為一種新的方法。目前在骨水泥中添加的抗菌離子有 Ag+、Cu2+、Co3+和 Fe2+等[8-9]。其中 Ag+抗菌性能優(yōu)異，但其不是人體必需微量元素。銅、鐵和鈷都是人體必需的微量元素，參與許多重要的生理過(guò)程，諸如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量生成、氧氣運(yùn)輸、細(xì)胞代謝、血液凝固等[10]。近來(lái)研究還表明，將這些離子負(fù)載在磷酸鈣系材料上，可以促進(jìn)血管化，有利于骨修復(fù)進(jìn)程[11]。但目前的研究都主要集中于在透鈣磷石上負(fù)載一種金屬離子。但人體對(duì)多種金屬離子都有需求，而微量元素離子大多具有劑量效應(yīng)[12]，只負(fù)載一種金屬離子容易導(dǎo)致劑量超標(biāo)，造成副作用。本研究擬同時(shí)將微量銅、鐵和鈷金屬離子同時(shí)負(fù)載到透鈣磷石骨水泥上，觀察其對(duì)骨水泥顯微結(jié)構(gòu)與性能的影響，特別是抗菌性能和細(xì)胞親和性能的影響。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 復(fù)合骨水泥的制備

載Co、Fe、Cu離子β-磷酸鈣骨水泥按專利[13]的方法進(jìn)行。具體為：按摩爾量n[Cu]∶n[Co]∶n[Fe]∶n[Ca]∶n[P]=3∶3∶3∶291∶200的比例，將Ca(NO3)2·4H2O、Cu(NO3)2·3H2O、Co(NO3)2·6H2O、Fe(NO3)3·9H2O配置成離子濃度為0.1 mol/L的混合溶液A，同時(shí)將(NH4)2HPO4配置成0.1 mol/L的溶液B。在充分?jǐn)嚢璧臈l件下，將A液逐滴滴加到B液中，用氨水調(diào)節(jié)pH值在7～8之間，反應(yīng)4 h，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在冰水浴中進(jìn)行。然后將懸濁液在40 ℃下陳化 24 h，抽濾，去離子水和無(wú)水乙醇洗滌。隨后將濾餅在100 ℃下干燥24 h，在1100 ℃下包埋煅燒2 h，200目過(guò)篩，備用。

將所制備的載離子β-磷酸鈣(β-Ca3(PO4)2，β-TCP)與磷酸二氫鈣(Ca(H2PO4)2·H2O，MCPM)按摩爾比1∶1混勻，以0.5 mol/L檸檬酸為固化液，按3 g/mL的比例將固液調(diào)和30 s，將漿料快速填入模具，待固化后即得成品，命名為CFC-Bru。同時(shí)按文獻(xiàn)[14]的方法制備未摻雜的透鈣磷石骨水泥Bru作為對(duì)比。

1.2 固化時(shí)間、可注射及抗?jié)⑿阅軝z測(cè)

將材料在相對(duì)濕度100%，37 ℃的恒溫條件下，制成Φ5 mm × 10 mm的柱體。在400 N的負(fù)荷下，用一個(gè)針尖直徑為1 mm的不銹鋼針扎材料表面，至不能產(chǎn)生壓痕所用時(shí)間為骨水泥固化時(shí)間[14]。每組5個(gè)試樣。

按文獻(xiàn)[14]方法測(cè)定可注射系數(shù)。具體為：取質(zhì)量為m0的5 mL注射器，在2 min內(nèi)將調(diào)拌好的骨水泥漿體移入注射器，將注射器與漿料的質(zhì)量記為m1。20 min后，用200 N的恒定力將注射器中的漿體注入到37 ℃生理鹽水中，直至不能推動(dòng)時(shí)，將注射器與剩余漿料的質(zhì)量記為m2，可注射率計(jì)算見(jiàn)式(1)。

(1)

為檢測(cè)抗?jié)⑸⑿阅埽瑢⒐撬酀{體注入37 ℃模擬體液中，10 min后觀察漿體是否潰散，并用數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.3 顯微結(jié)構(gòu)表征

骨水泥樣品固化后24 h，采用帶能譜(EDS，Energy Dispersive Spectrometer)的掃描電鏡(SEM，JSM-IT100, JEOL)觀察樣品的表面形貌。樣品充分研磨，然后使用X射線衍射儀(XRD，X ’Pert Pro MPD Panalytica)測(cè)量其晶相組成，采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR，Nicolet IS10, Thermofisher)測(cè)定其化學(xué)基團(tuán)。

1.4 降解性能檢測(cè)

按文獻(xiàn)[14]方法測(cè)定降解性能。將骨水泥制成大小為Φ 5 mm×10 mm的圓柱體，按固液比為1 g/20 mL的比例，將試樣置于37 ℃的模擬體液中，振蕩 7，14和21天后取出烘干、噴金，用掃描電鏡觀察分析材料的降解情況。

1.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

平板培養(yǎng)：將材料制成Φ 5 mm×2 mm的圓片，輻照滅菌[14]。購(gòu)自ATCC的大腸桿菌(35218)、金黃色葡萄球菌(25923)和銅綠桿菌(27853)作為菌種，采用平板抑菌圈法測(cè)試各試樣的抑菌性[15]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌圈。

肉湯培養(yǎng)：材料固化后研磨成粉末，輻照滅菌[14]。將3種細(xì)菌分別接種到的肉湯培養(yǎng)基中，使細(xì)菌濃度為106CFU/mL，菌液與材料按照固液比為10，20，50 mg/mL的比例，分別在每種有細(xì)菌的培養(yǎng)基中加入試驗(yàn)材料。培養(yǎng)18 h后倍稀適當(dāng)梯度，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)并倒推培養(yǎng)基中細(xì)菌濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，計(jì)算細(xì)菌濃度。

1.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1 MTT實(shí)驗(yàn)

樣品(Φ10 mm×2 mm)輻照滅菌[14]，然后按國(guó)標(biāo)GB/T 16886.5—2017[15]的方法制取浸提液，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，將細(xì)胞按每孔2×103個(gè)細(xì)胞的濃度接種到96孔板中，隔天更換培養(yǎng)液。在1，3和7 d后分別檢測(cè)其在570 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.6.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

樣品(Φ5 mm×2 mm)輻照滅菌[14]，將1×104個(gè)MG-63細(xì)胞接種在其表面，在37 ℃、5% CO2下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液[16]。在細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)1，3和7 d后，用4%多聚甲醛固定過(guò)夜，后用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精梯度脫水(每個(gè)濃度2次，每次15 min)，然后噴金、用掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 固化時(shí)間、可注射、抗?jié)⑸⒓敖到庑阅?/h3>

從圖1 (a)可見(jiàn)，純骨水泥Bru的固化時(shí)間約為8 min，而摻雜離子的復(fù)合骨水泥固化時(shí)間約30 min。臨床上要求，骨水泥的固化時(shí)間不能過(guò)短，以便留給醫(yī)師足夠的塑形時(shí)間，但亦不能過(guò)長(zhǎng)，以防產(chǎn)生炎癥應(yīng)答等其他副作用。本實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)合骨水泥固化時(shí)間在30 min左右，滿足基本要求[17]。圖1 (b) 表明，CFC-Bru在漿體移入注射器20 min時(shí)可注射系數(shù)約為90%，有利于實(shí)現(xiàn)臨床微創(chuàng)注射治療[18]。圖1 (b)培養(yǎng)皿中為CFC-Bru漿體在注射入37 ℃生理鹽水10 min后的形態(tài)，可見(jiàn)材料保持高度的完整性，未觀察到崩潰行為，表明材料抗?jié)⑸⒘己谩？節(jié)⑸⑿允枪撬嘣谘骸⑺蛩芤旱撵o水壓力下抗?jié)B防潰散的能力[19]。本實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)合骨水泥能在固化前后短時(shí)間內(nèi)經(jīng)受住模擬液體的浸潤(rùn)、沖洗而不稀散，保持完整性，預(yù)期其在體內(nèi)也能抗?jié)B、抗?jié)⑸ⅲ苊夤袒瘯r(shí)小顆粒的游離而引起副作用。而對(duì)比樣Bru在20 min時(shí)已完全固化不可注射。

表1 材料指紋區(qū)的紅外波峰列表

圖1 骨水泥的固化時(shí)間 (a), 可注射系數(shù)和CFC-Bru的抗?jié)⑸⑿?(b)Fig 1 Setting time, injectability and anti-washable ability of CFC-Bru

2.2 顯微結(jié)構(gòu)

圖2(a)為材料的XRD圖譜。由圖可見(jiàn)，Bru的晶相幾乎全部為透鈣磷石(PDF # 01-009-0077)，而復(fù)合骨水泥的晶相則發(fā)生了顯著改變，主要由透鈣磷石(CaHPO4·2H2O，Brushite, PDF # 01-009-0077)與未反應(yīng)完的磷酸二氫鈣(Ca(H2PO4)2(H2O)，MCPM，PDF # 01-071-0656)組成。紅外結(jié)果(圖2 (b)與表1)表明，與Bru相比，摻雜使材料的基團(tuán)也發(fā)生了顯著變化：一方面，其透鈣磷石HPO4-在 987，872，795，及 578 cm-1處的特征峰吸收強(qiáng)度顯著降低，這與XRD檢測(cè)到的透鈣磷石晶相顯著減少相一致；另一方面，HPO4-在1138、1 063、872 cm-1[20-21]等處的特征基團(tuán)發(fā)生了藍(lán)移，這可能是因?yàn)镃o、Fe、Cu離子的荷徑比高于Ca離子更高，誘導(dǎo)晶格畸變而造成；此外，一些新的磷酸根吸收峰726、611、543 cm-1[22-23]出現(xiàn)可歸因于一些其他的磷酸鹽的存在。

圖2 材料的XRD圖譜和FT-IR圖譜Fig 2 XRD patterns and FT-IR spectra of cements

圖3 骨水泥的表面形貌及能譜圖Fig 3 SEM and EDS of the cements

從材料的顯微形貌(圖 (3))可以看出，Bru表面由薄片狀晶粒組成，EDS測(cè)得其Ca、P比接近1∶1，與XRD中透鈣磷石材料主晶型的Ca、P比一致。而CFC-Bru表面的晶粒明顯增厚，EDS顯示其Ca、P比亦接近1∶1，同時(shí)檢測(cè)到了Co、Fe、Cu元素的存在，比例與摻入比例大體一致。

以上微觀檢測(cè)結(jié)果表明，加入了3種金屬離子后，材料的晶相組成、基團(tuán)組成及顯微形貌均顯著改變，說(shuō)明負(fù)載3種離子的磷酸鈣原料會(huì)嚴(yán)重影響到骨水泥的水化過(guò)程，這也進(jìn)一步解釋了宏觀上觀察到骨水泥固化時(shí)間延長(zhǎng)的現(xiàn)象。

2.3 降解性能

圖4為骨水泥在模擬體液中浸泡7，14，和21天的掃描電鏡圖。由圖可見(jiàn)，兩種材料在浸泡后均出現(xiàn)了降解現(xiàn)象，晶體被沖散，變小，出現(xiàn)了裂縫和孔洞。特別在21天時(shí)，CFC-Bru材料的孔洞比純骨水泥更加明顯，說(shuō)明其降解更快。

所觀察到的降解現(xiàn)象與材料的微觀檢測(cè)結(jié)果互相印證：載三種金屬離子的骨水泥材料晶體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)生成受到3種金屬離子影響，結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)固，其晶相組成、基團(tuán)組成及顯微形貌，均顯著改變，導(dǎo)致降解快于純骨水泥。

圖4 骨水泥在模擬體液中浸泡7，14，和21天的表面形貌Fig 4 Surface morphology of bone cements soaked in simulated body fluid for 7, 14, and 21 days

2.4 細(xì)菌實(shí)驗(yàn)

圖5(a)為材料的平板抑菌效果圖。可見(jiàn)純透鈣磷石骨水泥對(duì)3種細(xì)菌均不敏感，基本無(wú)抑菌性能，而復(fù)合骨水泥則對(duì)3種細(xì)菌均顯示出抑制效果，材料對(duì)銅綠桿菌、金色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑(圖5(b))分別達(dá)到了約25、15和11 mm。

圖5 (a)平板培養(yǎng)18 h后材料的抑菌圈；(b)平板培養(yǎng)18 h后材料的抑菌直徑Fig 5 Antibacterial property of cements after 18 h of culture in plates and diameter of the inhibition halos of cement materials after 18 h of culture in plates

表2 在不同材料不同濃度下不同細(xì)菌肉湯培養(yǎng)18 h后平板計(jì)數(shù)法計(jì)算出的菌落濃度

Table 2 The concentration of bacteria was cultured the nutrient broth for 18 h in different concentrations of different materials

不同材料下不同細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度 細(xì)菌種類 材料細(xì)菌濃度/CFU·mL-1空白組材料濃度10/mg·mL-120/mg·mL-150/mg·mL-1銅綠桿菌Bru(1.8±0.2)×1010(1.7±0.1)×1010(1.0±0.1)×1010(8.3±0.1)×109CFC-Bru(1.8±0.1)×1010(2.1±0.1)×106(1.1±0.1)×1060大腸桿菌Bru(1.4±0.1)×1010(1.4±0.1)×1010(1.1±0.1)×1010(1.0±0.1)×1010CFC-Bru(1.4±0.1)×1010(1.2±0.1)×107(1.3±0.1)×106(1.1±0.1)×106金色葡萄球菌Bru(2.3±0.2)×1010(2.0±0.1)×1010(9.2±0.1)×109(6.2±0.1)×109CFC-Bru(2.3±0.1)×1010(1.3±0.1)×108(1.5±0.1)×1070

圖6為材料在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后的抑菌效果圖。可見(jiàn)純透鈣磷石骨水泥組與只加細(xì)菌的肉湯培養(yǎng)基組渾濁度相近，而復(fù)合骨水泥組的渾濁度隨著材料濃度的增加逐漸變清晰透明，接近不加細(xì)菌純培養(yǎng)基組。肉湯培養(yǎng)18 h后涂板計(jì)數(shù)結(jié)果(圖7與表2)與圖6的渾濁度對(duì)比圖結(jié)果一致。在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后，未添加材料的銅綠桿菌、大腸桿菌、金色葡萄球菌組涂板后的細(xì)菌濃度分別為(1.8±0.2)×1010，(1.4±0.1)×1010，(2.3±0.2)×1010CFU/mL。純骨水泥組與未添加材料組細(xì)菌濃度基本相同(表2)。而CFC-Bru組在材料濃度為10，20，和50 mg/mL時(shí)，銅綠桿菌細(xì)菌濃度分別為(2.1±0.1)×106，(1.1±0.1)×106，和0CFU/mL；大腸桿菌細(xì)菌濃度分別為(1.2±0.1)×107，(1.3±0.1)×106，和(1.1±0.1)×106CFU/mL；金色葡萄球菌細(xì)菌濃度分別為(1.3±0.1)×108，(1.5±0.1)×107，和0 CFU/mL。可見(jiàn)，材料在肉湯培養(yǎng)中亦表現(xiàn)出抑菌性能，且隨著材料濃度的增加，抑菌力增強(qiáng)。比較三種細(xì)菌涂板計(jì)數(shù)結(jié)果可見(jiàn)，CFC-Bru在肉湯培養(yǎng)基中對(duì)銅綠桿菌的抑菌效果最好，濃度為10 mg/mL基時(shí)本就可以完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；對(duì)大腸桿菌的抑制生長(zhǎng)效果次之，濃度為10 mg/mL僅有少量的細(xì)菌生長(zhǎng)，為20 mg/mL時(shí)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；對(duì)金色葡萄球菌的抑制效果較弱，在50 mg/mL的濃度下完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

從平板培養(yǎng)和肉湯培養(yǎng)結(jié)果均可以看出，復(fù)合骨水泥均具有良好抑菌性能。報(bào)道指出，金屬離子所帶的負(fù)電荷容易與菌體細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的完整性，從而起到抗菌作用；另一方面，這些金屬離子甚至可以在進(jìn)入胞體后產(chǎn)生Fenton效應(yīng)，從而起到抑菌作用[15,24]。

Uskokovic等[1]研究發(fā)現(xiàn)只摻Fe元素的透鈣磷石骨水泥在平板實(shí)驗(yàn)有抑菌性能，但在肉湯實(shí)驗(yàn)中卻沒(méi)有抑菌能力。Wekwejt 等[25]研究結(jié)果表明只摻Cu元素的透鈣磷石骨水泥在平板實(shí)驗(yàn)有抑菌性能，但在肉湯實(shí)驗(yàn)中抑菌能力較差。同時(shí)，只摻Co元素的透鈣磷石骨水泥有抑菌性能，但肉湯抗菌性能未見(jiàn)報(bào)道[26]。本研究表明，含Cu、Fe、Co的復(fù)合骨水泥在平板實(shí)驗(yàn)與肉湯實(shí)驗(yàn)中均具有良好的抑菌性能，為以后研究復(fù)合抗菌骨水泥提供了良好的思路。

2.4 MTT及細(xì)胞黏附

圖8為MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖可見(jiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞吸光值逐漸上升。雖然培養(yǎng)7天后，骨水泥材料的吸光值都略低于對(duì)照組，但是細(xì)胞的存活率約為95%，說(shuō)明材料不具有細(xì)胞毒性[15]

圖8 MG-63細(xì)胞培養(yǎng)1, 3和7 d后的吸光度值(以空白組為對(duì)照組，*p ≤ 0.05，有顯著性差異)Fig 8 Absorbance values (OD values) of cements in the cell (MG-63) proliferation tests on days 1, 3 and 7 days (contrasted with the blank control, *p ≤ 0.05 is considered significant difference)

圖9 材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)1, 3和7 d后，樣品表面MG-63細(xì)胞形貌(箭頭所指)Fig 9 MG-63 cell morphology on the cement samples after co-culturing for 1, 3 and 7 days. The cells were pointed out by arrows

將材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)3 d后，觀察到細(xì)胞在材料上粘附，伸開(kāi)偽足生長(zhǎng)(圖9)。在7 d后，細(xì)胞更充分伸展，在材料表面伸出偽足與材料緊密貼附，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)融合，說(shuō)明材料對(duì)細(xì)胞具有良好的親和性能。

3 結(jié) 論

在透鈣磷石骨水泥磷酸鹽固相粉體中負(fù)載Co、Fe和Cu 3種離子后：

(1)骨水泥的固化時(shí)間從8 min延長(zhǎng)到約30 min，仍可抗?jié)⑸ⅲ勺⑸洌?/p>

(2)骨水泥的晶相組成、基團(tuán)結(jié)構(gòu)和表面形貌均發(fā)生顯著改變；

(3)骨水泥更易降解；

(4)骨水泥在平板實(shí)驗(yàn)與肉湯實(shí)驗(yàn)中均顯現(xiàn)出良好的抑菌性能；

(5)骨水泥無(wú)細(xì)胞毒性，且材料細(xì)胞親和性好，細(xì)胞可在其表面伸展、生長(zhǎng)、增殖。