微RNA-129-5p 靶向Fas 相關死亡功能域蛋白基因對體外培養人椎間盤髓核細胞凋亡的影響

姜 巖，張 陸，高軍勝，張 沖，劉 杰

鄭州人民醫院骨科，鄭州 450000

椎間盤退行性變是導致下腰痛的主要原因之一［1］，超過80%的人在其一生中會經歷一次或多次下腰痛或肩頸痛，嚴重影響生活質量［2］。椎間盤由外圍的纖維環、中心的髓核和上下終板構成，已有研究證明，椎間盤髓核細胞的異常凋亡是引起髓核細胞數量減少的關鍵因素，從而引起椎間盤退行性變［3］。Fas 相關死亡功能域蛋白（FADD）是Fas/FasL系統信號轉導通路中介導細胞凋亡的胞漿死亡信號蛋白，它可以調節半胱氨酸蛋白酶（Caspase）蛋白表達，誘導細胞的凋亡［4］。

微RNA（miRNA）是一類由19 ~ 25個核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，通過降解靶基因mRNA或阻止其蛋白翻譯對靶基因進行調節，研究發現miRNA參與調節椎間盤退行性變的生理病理過程［5］。miRNA-129-5p（miR-129-5p）是近年發現的一種腫瘤抑制miRNA［6-8］，陳宇飛［9］的研究發現，發生退行性變的椎間盤髓核組織中miR-129-5p 表達下調，上調其表達對椎間盤有保護作用，且miR-129-5p 可以靶向作用Ⅰ型膠原基因和整合素α1 基因而影響細胞生物學功能。但miR-129-5p 在髓核細胞中是否影響細胞的凋亡及相關機制尚不清楚。本研究通過體外實驗探究miR-129-5p 是否通過調控FADD 影響人椎間盤髓核細胞（hNPC）凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

hNPC 購自美國ScienCell 公司；胎牛血清、DMEM 培養液購自美國HyClone 公司；胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒購自美國Coulter公司；聚偏二氟乙烯膜、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、電化學發光液購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑、miR 陰性對照物（miR-NC）、miR-219-5p 模擬子（miR-219-5p mimics）、抑制子陰性對照物（inhibitor NC）、miR-219-5p 抑 制 子（miR-219-5p inhibitor）、FADD 小 干擾RNA（FADD siRNA）和小干擾RNA 陰性對照物（siRNA NC）購自美國Invitrogen公司；pcDNA-FADD過表達載體由南京金瑞斯生物科技公司構建；兔抗人β-actin多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax 多克隆抗體、兔抗人Cleaved Caspase-3多克隆抗體、兔抗人FADD 多克隆抗體購自美國Proteintech Group 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自武漢博海生物工程有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；MCO-18AC型CO2培養箱購自日本SANYO公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養

將hNPC 培養于含有10%胎牛血清的DMEM 培養基中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每隔24 h更換1 次培養液，待細胞貼壁約80%時加入胰蛋白酶進行消化傳代。

1.3 細胞轉染與分組

收集融合度約40%的hNPC，加入胰蛋白酶消化并重懸，以1×105個/孔的密度接種至24孔板，常規培養24 h。按照LipofectamineTM2000轉染試劑使用說明將miR-NC、miR-219-5p mimics、inhibitor NC、miR-219-5p inhibitor、pcDNA、pcDNA-FADD、miR-219-5p inhibitor+siRNA NC、miR-219-5p inhibitor+FADD siRNA 分別轉染至hNPC，標記為miR-con 組、miR組、anti-miR-con組、anti-miR組、pcDNA組、pcDNAFADD 組、anti-miR-siRNA-con 組、anti-miR-siRNA組；以未轉染的細胞為空白對照，記為Blank 組。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測miR-219-5p的表達

將轉染48 h 的細胞充分研磨，TRIzol 法提取總RNA，檢測RNA 純度和濃度。使用反轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）將RNA 反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒（日本TaKaRa 公司）使用說明配制反應體系，以β-actin 為內參，置于實時熒光定量PCR 儀上進行擴增，每個樣品重復3 次，采用2-△△Ct法 分 析 實 驗 結 果。miR-219-5p 正 向 引 物為5′-GGGTCTTAACGCAAACCT-3′，反 向 引 物 為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；β-actin 正 向 引 物為5′-CCTGTGGCATCCACGAAACT-3′，反向引物為5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集轉染48 h的細胞，加入預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，加入胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。每組設3 個復孔，實驗重復3 次。

1.6 蛋白質印跡法檢測凋亡蛋白和FADD的表達

收集轉染48 h 的細胞，超聲粉碎，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液于冰上裂解5 min，4℃、12 000×g（1 g=9.806 65 m/s2）離 心15 min，收 集上清。將蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至聚偏二氟乙烯膜，加入5%脫脂奶粉封閉2 h。加入稀釋過的一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h。TBST漂洗3次，每次10 min，ECL試劑盒發光顯影。將膠片用Quantity One 凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的光密度，以目的條帶和β-actin 條帶光密度的比值作為蛋白表達水平。每組設3 個復孔，實驗重復3 次。

1.7 熒光素酶報告基因實驗

Targetscan 在線預測發現FADD 3′-UTR 上存在miR-219-5p 的結合位點。為進一步驗證FADD 是否為miR-219-5p 的靶基因，按照Lipofectamine 2000 使用說明書，將構建好的野生型FADD 3′-UTR-WT（含FADD 3′-UTR 片 段）和 突 變 型FADD 3′-UTR-MUT（FADD 3′-UTR 片段突變體）載體分別與miR-219-5p mimic 共轉染至293T 細胞，培養48 h 后檢測熒光素酶活性，以相對熒光強度表示（相對熒光強度=螢火蟲熒光強度/海腎熒光強度）。

1.8 統計學處理

采用SPSS 20.0 軟件對數據進行統計學分析，數據以表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；以P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 抑制miR-129-5p表達對hNPC凋亡的影響

實時熒光定量PCR 檢測結果顯示，anti-miR 組hNPC 中miR-129-5p 的 表 達 量 與anti-miR-con 組 相比明顯降低（P < 0.05，圖1），表明miR-129-5p 的表達被成功抑制。流式細胞術檢測結果顯示，與antimiR-con 組相比，anti-miR 組hNPC 的凋亡率明顯升高（P < 0.05，圖2）。蛋白質印跡分析結果顯示，與anti-miR-con 組相比，anti-miR 組hNPC 中促凋亡相關蛋白活化型Caspase-3 表達上調（P < 0.05），抑凋亡相關蛋白Bcl-2 表達下調（P < 0.05），Bax 蛋白表達量無明顯變化（圖3），結果表明抑制miR-129-5p表達能明顯促進hNPC 凋亡。

圖1 實時熒光定量PCR 檢測hNPC 中miR-129-5p的表達Fig. 1 miR-129-5p expression in hNPCs detected by real-time quantitative PCR

圖2 流式細胞術檢測抑制miR-129-5p表達后hNPC 的凋亡率Fig. 2 Apoptosis rate of hNPCs after inhibiting miR-129-5p detected by flow cytometry

圖3 蛋白質印跡分析檢測hNPC 中凋亡蛋白的表達Fig. 3 Expression of apoptotic protein in hNPCs detected by Western blotting

2.2 miR-129-5p靶向FADD影響hNPC凋亡

通過Targetscan在線預測發現，FADD 3′-UTR上存在miR-129-5p的結合位點（圖4a）；雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，將miR-129-5p mimics與FADD 3′-UTR野生型質粒共轉染后細胞熒光素酶活性下降（P < 0.05），與FADD 3′-UTR突變型質粒共轉染后細胞熒光素酶活性無明顯變化（P > 0.05，圖4b）；蛋白質印跡分析結果顯示，與anti-miR-con 組相比，miR組hNPC 的FADD 表 達 下 調（P < 0.05），anti-miR 組hNPC 的FADD表達上調（P < 0.05，圖4c）。

圖4 miR-129-5p靶向FADD 的預測和驗證結果Fig. 4 Predicting and validation results of miR-129-5p targeting FADDa：FADD 3′-UTR與miR-129-5p 的結合位點 b：雙熒光素酶報告實驗 c：蛋白質印跡分析a：Binding site of FADD 3′-UTR and mir-129-5p b：Dual-luciferase reporter gene assay c：Western blotting

轉 染pcDNA-FADD 至hNPC 后，pcDNA-FADD組hNPC 的FADD 表達量與pcDNA 組相比明顯增加（P < 0.05，圖5a），細胞凋亡率明顯升高（P < 0.05，圖5b），表明過表達FADD 可誘導hNPC 凋亡。抑制miR-129-5p 表達后，anti-miR 組hNPC 的FADD 表達量與anti-miR-con 組相比明顯增加（P < 0.05，圖6a），細胞凋亡率明顯升高（P < 0.05，圖6b）；同時抑制miR-129-5p 和FADD 表達后，anti-miR-siRNA組的FADD 表達量與anti-miR-siRNA-con 組相比明顯降低（P < 0.05，圖6a），細胞凋亡率也明顯降低（P < 0.05，圖6b），表明miR-129-5p 抑制后FADD 表達上調促進hNPC 凋亡。

圖5 過表達FADD 誘導hNPC凋亡Fig. 5 hNPC apoptosis induced by over-expression of FADD a：蛋白質印跡法檢測FADD表達 b：流式細胞術檢測hNPC 凋亡a：Detection of FADD expression by Western blotting b：Detection of hNPC apoptosis by flow cytometry

圖6 抑制miR-129-5p和FADD 對hNPC 凋亡的影響Fig. 6 Effect of inhibiting miR-129-5p and FADD on hNPC apoptosisa：蛋白質印跡法檢測FADD表達 b：流式細胞術檢測hNPC 凋亡a：Detection of FADD expression by Western blotting b：Detection of hNPC apoptosis by flow cytometry

3 討 論

椎間盤退行性疾病引起的慢性腰腿痛、頸肩痛嚴重影響人們的正常生活［10］，目前臨床上有多種針對椎間盤退行性疾病的治療手段，包括藥物治療、物理治療和手術治療［11］。椎間盤退行性變是自然老化、退化的生理病理過程，受多種因素影響，是一系列脊柱退行性疾病的前提和病理基礎［12-13］。椎間盤組織再生能力有限，發生退行性變后較難逆轉［14］，患者癥狀存在反復發作的風險。因此，探索椎間盤退行性變的分子機制對發掘新型治療手段具有重要意義。

細胞凋亡所造成的椎間盤細胞數量減少、細胞外基質合成減少和成分改變是導致椎間盤退行性變的關鍵環節［15］。在發生退行性變的椎間盤中可以觀察到髓核細胞的凋亡速率明顯加快［16］。細胞凋亡的過程中有多種蛋白參與，如Caspase 系列蛋白、Bcl-2 蛋白和p53 蛋白等［17-18］。研究發現，長鏈非編碼RNAGAS5 過表達后Caspase-3 表達上調，凋亡抑制蛋白Bcl-2 表達下調，髓核細胞的凋亡率升高［19］。FADD 基因在組織中表達異常與腫瘤的發生、發展關系密切，在人膠質母細胞瘤細胞中，FADD 過表達可抑制細胞增殖并促進細胞凋亡［20］。FADD 在發生退行性變的hNPC 中高表達，miR-155 通過調控FADD和Caspase-3抑制hNPC凋亡［21］。本研究發現，轉染pcDNA-FADD 至hNPC 后，FADD 表達量明顯增加，hNPC 的凋亡率也明顯增加，表明FADD 過表達可促進hNPC 凋亡。

多種miRNA 可通過作用于細胞凋亡影響椎間盤退行性變的發生和發展。Liu 等［22］的研究發現，體外轉染miR-125a 后，髓核細胞凋亡減少，同時Caspase-3、Bax 的蛋白表達量下降，Bcl-2 表達上調。Zhang 等［23］的研究發現，在發生退行性變的椎間盤組織中miR-210 表達降低，導致HOXA9 蛋白表達上調，并通過Fas 通路介導髓核細胞凋亡。Zhao等［24］的研究發現，miR-129-5p 的甲基化通過靶向Beclin-1 在椎間盤退行性變中阻斷髓核細胞自噬。陳宇飛［9］的研究發現，miR-129-5p 在發生退行性變的椎間盤髓核組織中低表達，過表達miR-129-5p 可以抑制人椎間盤髓核細胞發生退行性變，對椎間盤起保護作用。本研究發現，在hNPC 中下調miR-219-5p 的表達，hNPC 的凋亡率明顯升高，促凋亡蛋白Caspase-3 的表達量明顯升高，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯下降。通過Targetscan 軟件預測發現miR-219-5p 與FADD 有結合位點，熒光素酶報告基因實驗證實miR-219-5p與FADD之間存在靶向關系。在hNPC 中，上調miR-219-5p 可抑制FADD 的表達，下調miR-219-5p 可促進FADD 的表達。將miR-219-5p inhibitor 和FADD siRNA 共 轉 染 至hNPC 后 發 現與hNPC 凋亡率降低，表明抑制FADD 可逆轉miR-219-5p低表達對hNPC凋亡的促進作用，進一步說明miR-219-5p低表達通過上調FADD促進細胞凋亡。

綜上所述，抑制miR-219-5p 的表達可促進hNPC 中FADD 表達，hNPC 凋亡率也隨之升高，表明miR-219-5p 可靶向作用FADD 調控hNPC 的凋亡，這為椎間盤退行性變的分子治療提供了新靶點。