鴨圓環(huán)病毒基因Ⅱ型毒株P(guān)CR鑒定

康代利 王鑫

【摘要】鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）自從2003年被Hattermann發(fā)現(xiàn)以來，在我國各地區(qū)均有相關(guān)報道。鴨圓環(huán)病毒是一種無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒，病毒感染后會侵害機(jī)體的免疫器官，引發(fā)免疫抑制性疾病，使鴨的死亡數(shù)量增加。本研究主要通過對實(shí)驗(yàn)室送檢的病料進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測，將檢測出的呈陽性的病料送檢后進(jìn)行序列比對分析。經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)送檢樣品為DuCV基因II型陽性病料，該結(jié)果為養(yǎng)殖場內(nèi)鴨群感染情況提供了病原學(xué)流行情況的參考價值。

【關(guān)鍵詞】鴨圓環(huán)病毒（DuCV）;PCR;DuCV-2型毒株

鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus， DuCV）是一種無囊膜單股環(huán)狀DNA病毒，結(jié)構(gòu)為二十面體對稱，屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）、圓環(huán)病毒屬（Circovirus），該病毒直徑大小為15-16nm[1]，當(dāng)鴨感染病毒后在鴨的心、肝、脾、肺、法氏囊、胸腺中均可發(fā)現(xiàn)DuCV，尤其在法氏囊、肺、胸腺中DuCV居多[2]，這也是鴨圓環(huán)病毒主要侵害的部位。鴨圓環(huán)病毒主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，造成機(jī)體的免疫功能和機(jī)體對疫苗的免疫應(yīng)答能力下降，使各類疫苗免疫效果減弱進(jìn)而導(dǎo)致免疫失敗，各種細(xì)菌和病毒容易侵入機(jī)體，引發(fā)鴨病的混合感染和繼發(fā)感染現(xiàn)象增多[1]。感染后鴨的臨床癥狀主要表現(xiàn)為羽毛凌亂、體重減輕、飼料轉(zhuǎn)化率降低、精神低沉等[3-5]。對病鴨進(jìn)行病理學(xué)檢查，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)病鴨的背部羽毛出現(xiàn)囊泡，且囊泡周圍有炎性滲出，剖解可見脾臟、胸腺出現(xiàn)萎縮，并且散布一些大小不等、數(shù)量不一的白色病灶[3]。

在我國內(nèi)陸地區(qū)，姜世金首先于2007年在福建省某鴨場的鴨群中檢測到鴨圓環(huán)病毒[6]。隨后，傅光華等于2008年在番鴨中檢測到鴨圓環(huán)病毒，并克隆出了該病毒的全基因序列[7]。李志國等通過對種鴨血清陽性率較高的鴨場中孵化過程中死亡的胚胎以及剛出生不久的雛鴨進(jìn)行鴨圓環(huán)病毒檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在死亡的胚胎以及雛鴨中有鴨圓環(huán)病毒存在，這就表明鴨圓環(huán)病毒的傳播方式除了鴨群個體間的水平傳播以外，還有可能存在由親代傳遞給子代的垂直傳播[8]。

根據(jù)DuCV的Cap蛋白的基因序列，可將DuCV分為兩個基因型，即基因Ⅰ型和基因Ⅱ型[9-11]。同時，由于鴨圓環(huán)病毒發(fā)現(xiàn)較晚且缺乏適宜的體外培養(yǎng)方法，所以當(dāng)前對鴨圓環(huán)病毒的研究主要集中在核酸和蛋白的相關(guān)檢測追蹤。目前，對于鴨圓環(huán)病毒已經(jīng)報道的分子生物學(xué)檢測方法主要包括常規(guī)PCR檢測法、核酸探針檢測法[12]、套式PCR檢測法[13]、多重PCR檢測法、熒光定量PCR檢測法[5-9]以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)[11]等方法。其中利用最廣泛、操作最簡便的檢測法是常規(guī)PCR檢測法，常規(guī)PCR檢測法就是指在DNA聚合酶的催化作用下，對所需的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，其過程主要包括變性、退火、延伸，該過程在經(jīng)過多次循環(huán)重復(fù)后可得到擴(kuò)增的目的DNA片段。此次研究便是采用常規(guī)PCR檢測法對送檢病料進(jìn)行測序，從而得出檢測的樣本為鴨圓環(huán)病毒基因Ⅱ型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集? 在山東臨沂某鴨場，對疑似感染鴨圓環(huán)的病鴨在死亡后無菌采集臟器病料（主要臟器包括法氏囊、胸腺、肺、心、肝、脾等），采集后送至實(shí)驗(yàn)室低溫保存。

1.1.2試劑? Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒（包括裂解液、去蛋白漂洗液、洗滌液、洗脫液、純化柱）、PCR反應(yīng)體系、PBS緩沖液、RO水、50xTAE、DL2000 DNA maker、Loading Buffer染液、GeneGreen核酸染料

1.1.3器材? 移液槍、槍頭、組織研磨器、BIO-RAD T100 型PCR儀、離心機(jī)、振蕩器、電子天平、恒溫水浴鍋、計時器、微波爐、電泳儀、電泳槽、制膠板、BIO-RAD Gel Doc XR型凝膠成像儀

1.2方法和步驟

1.2.1樣本前處理? （1）在-80℃冰箱中取鴨肝臟和肺臟組織，在無菌操作臺上用消過毒的剪刀剪下約黃豆大小的組織碎片（約0.1g），用鑷子將組織碎片分別放入兩個微型離心管內(nèi)，然后加入500uL PBS緩沖液，為使組織碎片充分研磨應(yīng)向試管內(nèi)加入一粒小鋼珠，在研磨結(jié)束后要將小鋼珠取出。（2）將離心管放入組織研磨儀的兩個研磨適配器中，離心管要盡量對稱放置同時要注意將研磨適配器固定牢固以免研磨適配器高速運(yùn)動時打碎研磨儀玻璃。隨后給研磨儀通電開機(jī)設(shè)置儀器參數(shù)，設(shè)置其參數(shù)為：研磨設(shè)定頻率為50Hz、研磨運(yùn)行時間為60s、研磨中斷時間為10s、研磨運(yùn)行次數(shù)為8次。設(shè)置完畢后點(diǎn)擊控制面板上的Start鍵使研磨儀開始研磨。（3）待研磨完畢后，用鑷子取出管內(nèi)小鋼珠，放入燒杯內(nèi)用無水乙醇浸潤清潔，防止鋼柱表面有碎片組織殘留。隨后將取出小鋼珠的兩個離心管置于離心機(jī)內(nèi)，設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為10000rpm，進(jìn)行離心操作1min，待離心操作完畢后再用移液槍吸取一定量的上清液，然后將上清液放入新的離心管內(nèi)進(jìn)行樣本提取。

1.2.2樣本提取操作 （1）用移液槍吸取200μL已處理好的樣本并將其加入到一個新的離心管中，隨后將移液槍更換槍頭后吸取500μL的裂解液加入其中，然后將離心管放在振蕩器上進(jìn)行振蕩，使混合液振蕩混勻，振蕩時長約為30s。在振蕩過程完成之后再把離心管置于室溫中，放置10min。（2）將振蕩混勻后的混合液用移液槍轉(zhuǎn)移至純化柱內(nèi)，然后將離心時間設(shè)置為60s，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為10000rpm，待離心結(jié)束后丟棄接液管中的廢棄液體。（3） 更換槍頭后用移液槍吸取500μL的蛋白漂洗液，將其加入純化柱中，離心時長設(shè)置為30s，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為12000rpm，待離心結(jié)束后丟棄接液管中的廢棄液體。（4）更換槍頭后用移液槍吸取500μL的洗滌液，將其加入純化柱中，離心時長設(shè)置為30s，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為12000rpm，待離心結(jié)束后丟棄接液管中的廢棄液體。（5）更換槍頭后再次用移液槍吸取500μL的洗滌液，將其加入純化柱中，離心時長設(shè)置為30s，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為12000rpm，待離心結(jié)束后丟棄接液管中的廢棄液體。（6）上一步完成后，再次將純化柱放置于離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行離心操作，設(shè)置離心機(jī)的離心時長為120s，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm。（7）將接液管丟棄，然后準(zhǔn)備兩個新的1.5ml的離心管，把純化柱放置其中。再用移液槍吸取50μL洗脫液加入純化柱內(nèi)，然后把離心管置于恒定的室溫中，靜置時長為120s。（8）再次進(jìn)行離心操作，本次離心時間設(shè)置為50s，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為12000rpm，完成離心操作后將純化柱丟棄，此時組織中提取的DNA便存在于離心管內(nèi)。

1.2.3設(shè)計25μL PCR體系各試劑配比? （1）用移液槍吸取上下游引物各1μL加入到薄壁管內(nèi);（2）用移液槍吸取2×Taq PCR Mix 12.5μL加入到薄壁管內(nèi);（3）用移液槍吸取模板（核酸DNA）1μL加入到薄壁管內(nèi);（4）用移液槍吸取ddH2O 9.5μL，補(bǔ)齊至25μL。

1.2.4設(shè)置對照? （1）用移液槍吸取上下游引物各1μL加入到薄壁管內(nèi);（2）用移液槍吸取2×Taq PCR Mix 12.5μL加入到薄壁管內(nèi);（3）用移液槍吸取無菌水 1μL加入到薄壁管內(nèi);（4）用移液槍吸取ddH2O 9.5μL，補(bǔ)齊至25μL。注：為方便區(qū)分實(shí)驗(yàn)組和對照組應(yīng)在薄壁管的側(cè)壁及蓋子上用記號筆寫上編號。

1.2.5擴(kuò)增? 打開PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD T100 型），按照默認(rèn)的預(yù)定程序進(jìn)行設(shè)置操作，將上述含有模板DNA的反應(yīng)體系和對照組放入PCR儀內(nèi)。具體程序如下：（1） 95℃ 3min進(jìn)行預(yù)變性;（2）95℃ 30s進(jìn)行變性;（3）55℃ 30s進(jìn)行退火;（4）72℃ 1min進(jìn)行延伸;（5）循環(huán)（2）（3）（4）步驟35次;（6）再次進(jìn)行72℃延伸，5min。待以上步驟完成后，點(diǎn)擊控制面板上的Cancel鍵，然后打開PCR擴(kuò)增儀，取出樣品，取出后記得關(guān)閉PCR儀，在進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)前要先將樣品保存在4℃的冰箱中。

1.2.6凝膠板制備? （1）取20ml 50xTAE溶液，按1：49的比例配制1000ml 1xTAE溶液（即20ml 50xTAE溶液，980ml無菌水），配制好的溶液要充分振蕩混勻。（2）使用稱量天平稱取0.7g瓊脂糖粉末，放至于一個錐形瓶中，再將制備的700ml 1xTAE溶液加入錐形瓶，然后將錐形瓶小心的放于微波爐里，用中火或高火進(jìn)行加熱，直到瓶內(nèi)的液體沸騰為止，沸騰后拿出搖勻，使瓊脂糖均勻分散，然后繼續(xù)重復(fù)加熱至沸騰，直至溶液完全變的澄清透明，然后再用移液槍向錐形瓶加入7μL的GeneGreen核酸染料。（3）將有機(jī)玻璃制膠板槽水平放置，然后在一側(cè)插好梳子，再將之前制備好的混合液倒入制膠板槽中，倒入時應(yīng)小心均勻倒入，以免產(chǎn)生氣泡，隨后在室溫中冷卻50min左右，觀察凝膠是否完全凝固，當(dāng)凝膠完全凝固之后，為避免凝膠損壞應(yīng)該小心的將梳子向上垂直拔出。

1.2.7加樣? 用移液槍吸取適量的Loading Buffer染液均勻的滴在鋪平的塑料手套上，使之分成若干份。再用微量移液槍吸取DL2000 DNA maker10μL 、樣本A、陽性對照和陰性對照各5μL與Loading Buffer染液均勻混合后加入瓊脂中。

1.2.8電泳? （1）上述加樣步驟完成后將加樣孔置于陰極端放于電泳槽中，凝膠板要放置平整，不可歪斜，將配制好的1xTAE溶液加入到電泳槽中并使其水平液面超過凝膠表面。然后打開電源將電泳儀通電跑膠。（2）當(dāng)電泳進(jìn)行至40min左右時，可明顯觀察到染液有一定距離的移動。待電泳結(jié)束后，小心取出凝膠，將之放入凝膠成像系統(tǒng)中，打開機(jī)器紫外線按鈕，并打開電腦軟件進(jìn)行操作，就可得到電泳圖，然后將跑好的電泳圖拍照或截圖保存以作結(jié)果分析。

2結(jié)果與分析

2.1PCR檢測結(jié)果? 將PCR擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后可在凝膠成像系統(tǒng)中得到鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型基因型的條帶。如圖2-1，從結(jié)果中分析可得，DuCV-2引物擴(kuò)增出950bp左右的條帶，與陽性對照基本一致。

2.2鴨圓環(huán)病毒部分基因片段同源性分析? 將測序毒株LW4與NCBI數(shù)據(jù)庫中鴨圓環(huán)病毒部分基因進(jìn)行同源性序列分析， 經(jīng)過DNA Star軟件比對發(fā)現(xiàn)，分離株LW4與鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型與參考株（AY394721.seq）的同源性最高，可達(dá)100%，其次是與DQ166837株同源性達(dá)到99.8%，與其他參考株的同源性在82.7～99.8%之間（圖2-2），由此可確診為鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型。

2.3鴨圓環(huán)病毒部分基因片段系統(tǒng)基因進(jìn)化樹 利用DNA Star軟件對20株毒株進(jìn)行分析比較，可繪制出基因進(jìn)化樹（圖2-3），從圖中可得知DuCV-2與AY394721.seq位于基因進(jìn)化樹的同一分支上，所以這兩個毒株的親緣關(guān)系極近，判定為鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型。

M為2000marker; 1為肝臟組織擴(kuò)增條帶; 2為腎臟組織擴(kuò)增條帶; 3為肺臟組織擴(kuò)增條帶; 4為陽性對照; 5為陰性對照。

3討論

鴨圓環(huán)類病毒主要是侵害機(jī)體的免疫器官，引發(fā)免疫抑制性疾病，同時鴨圓環(huán)病毒可能會提高鴨疫里默氏桿菌、鴨瘟病毒等常發(fā)病的發(fā)病率[3][5]，并加重發(fā)病的臨床癥狀，使鴨的發(fā)病率也不斷增多，同時這表明鴨圓環(huán)病毒在繼發(fā)感染、交叉感染中起著重要作用。在感染鴨圓環(huán)病毒的鴨群中存在著羽毛發(fā)育不良、體重減輕、精神低沉等臨床癥狀，病理學(xué)檢查可見淋巴細(xì)胞損傷、減少，剖解可見法氏囊、胸腺萎縮，這些都表明鴨圓環(huán)病毒可引發(fā)免疫抑制[1]。目前，在我國各個省份的鴨場中均發(fā)現(xiàn)有DuCV感染病例的存在，山東又是肉鴨養(yǎng)殖較為集中的地區(qū)，為此王鑫[10]等通過利用間接ELISA檢測法對濰坊和泰安數(shù)十個鴨場的數(shù)千份血清進(jìn)行了鴨圓環(huán)病毒抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濰坊鴨場的陽性率明顯高于泰安，這主要是由于濰坊的鴨場建設(shè)早于泰安，這就表明了在一些老舊的鴨場中DuCV的污染率更高。另外，李志國等[9]通過對種鴨血清陽性率較高的鴨場中孵化過程中死亡的胚胎以及剛出生不久的雛鴨進(jìn)行DuCV檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在死亡的胚胎以及雛鴨中有DuCV存在，這就表明鴨圓環(huán)病毒的傳播方式不僅有水平傳播而且還有可能存在垂直傳播。總之，雖然目前對鴨圓環(huán)病毒有一定程度的了解但是由于鴨圓環(huán)病毒不能分離培養(yǎng)，所以對鴨圓環(huán)病毒的診斷和防治帶來一定的困難。利用簡單易操作靈敏度高的常規(guī)PCR對鴨圓環(huán)進(jìn)行檢測，這是目前比較行之有效的方法。本研究選用根據(jù)鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型保守序列所設(shè)計的特異引物對鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行凝膠電泳，將電泳好的凝膠放在凝膠成像儀下觀察，得出結(jié)果圖并進(jìn)行分析，最終在病料中檢測出的病毒基因型鑒定為鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型，這為鴨場此次發(fā)病的病因排查提出了有力的證據(jù)。

4結(jié)論

經(jīng)過對病料進(jìn)行電泳圖譜分析可確定病料為陽性，基因型為Ⅱ型基因型。在鑒定鴨圓環(huán)病毒及基因分型方面，常規(guī)PCR方法具有操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢，對以后鴨圓環(huán)病毒的研究提供了重要技術(shù)支持。

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通訊作者：王鑫，女，1985.7，動物病毒學(xué)研究，coala07@163.com