激光聯(lián)合全蝎軟膏治療增生性瘢痕療效評價

王景 張海麗

[摘要]目的：觀察并探討激光聯(lián)合全蝎軟膏對兔耳早期增生性瘢痕的治療效果。方法：將16只新西蘭大白兔隨機分為空白對照組、模型組、全蝎軟膏組和聯(lián)合組，每組4只;建模后立即對全蝎軟膏組和聯(lián)合組患處進行藥物涂抹或激光照射治療，對照組和模型組用PBS處理;于治療后的第50d取各組動物皮膚織進行病理、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、熒光定量PCR和Smad 4蛋白檢測。結果：與空白對照組相比，模型組兔耳術后形成增生性瘢痕，聯(lián)合組和全蝎軟膏組經(jīng)治療后無瘢痕出現(xiàn);HE染色結果顯示，經(jīng)激光聯(lián)合全蝎軟膏治療后組織纖維化程度明顯減輕;ELISA和熒光定量PCR檢測結果表明，聯(lián)合組與模型組相比，I型膠原蛋白（Col I）、Ⅲ型膠原蛋白（Col Ⅲ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及MMP的表達量均顯著降低（P<0.05）;Western blot結果證實了激光聯(lián)合全蝎軟膏治療后可顯著抑制組織內Smad 4蛋白的表達（P<0.05），從而調控TGF-β細胞通路而抑制增生性瘢痕的形成。結論：本研究證實了激光聯(lián)合全蝎軟膏具有治療HTS的作用，并為臨床上治療HTS提供新途徑。

[關鍵詞]全蝎軟膏;半導體激光;增生性瘢痕;早期治療;Smad 4蛋白;TGF-β通路

Abstract： Objective? To observe and explore the therapeutic effect of laser combined with scorpion ointment on early hypertrophic scar in rabbit ears. Methods? The sixteen New Zealand white rabbits were randomly divided into blank control group， model group， scorpion ointment group and combined group. After modeling， the patients in the treatment group were immediately treated with drug smear or laser irradiation， while those in the control and model groups were treated with PBS. On the fiftieth day after treatment， the skin tissues of each group were taken for pathological examination， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， fluorescence quantitative PCR and Smad 4 protein detection. Results Compared with the control group， hypertrophic scar was formed in the model group after ear surgery， and no scar appeared in the laser combined with scorpion ointment group after treatment. The results of HE staining showed that the degree of tissue fibrosis was significantly reduced after laser combined with scorpion ointment treatment. The results of ELISA and quantitative fluorescence PCR showed that the expressions of Col I， Col Ⅲ， TNF-a and MMP in the combined treatment group were significantly lower than those in the model group （P<0.05）. The western blot results confirmed that laser combined with scorpion ointment could significantly inhibit the expression of Smad 4 protein in tissues （P<0.05）， thereby regulating the TGF-β cell pathway and inhibiting the formation of hypertrophic scars. Conclusion This study confirms that laser combined with scorpion ointment can be used to treat HTS， and provides a new way for clinical treatment of HTS.

Key words： scorpion ointment; semiconductor saser; hypertrophic scar; preemptive therapy; smad 4 Protein; TGF-β pathway

增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HTS）是臨床上較為常見的病理性皮膚疾病，其形成的主要原因是組織在自我修復過程中成纖維細胞（Fibroblast，F(xiàn)B）過度增殖，同時以大量的膠原蛋白在細胞外基質（extracellular matrix，ECM）內沉積而最終導致高于正常皮膚組織的增生性瘢痕形成[1-3]。傳統(tǒng)醫(yī)學認為，增生性瘢痕發(fā)病的主要原因為“氣滯血瘀，余毒未盡”，此外，HTS的形成亦與氣虛、血虛和痰濕等個體體質因素相關[4-5]。目前，臨床上防治HTS的手段眾多，主要包括手術切除、壓迫療法、冷凍、放化療及藥物注射等，以及兩種或兩種以上聯(lián)用的綜合療法，但因HTS具體的形成機制尚未明確，致使治療效果均不理想，仍存在復發(fā)率較高、診療費用高等問題[6-7]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學倡導在HTS創(chuàng)傷形成和愈合的早期即采取治療措施，以“治未病”為指導思想，選擇療效好、副作用小、費用低，兼以活血化瘀，清除余毒的中藥制劑[8]。半導體激光因具有較強的組織修復、強力鎮(zhèn)痛、無副作用、無創(chuàng)傷及消炎、消水腫等功效，已在痤瘡、濕疹皮膚病等疾病輔助治療中取得了良好的應用效果[9]。此外，全蝎軟膏因其具有抗菌消炎、止痛止癢、活血化瘀及疏經(jīng)通絡之功效，被認為是繼丹參、積雪苷霜、三七總甙等又一可用于臨床治療HTS的潛在用藥，并已成功作為如下肢靜脈潰瘍、糖尿病足和干燥性鼻炎等疾病的治療手段之一[10-12]。本研究通過建立兔耳增生性瘢痕模型，對半導體激光聯(lián)合全蝎軟膏治療HTS的效果進行綜合評價，以期為臨床治療早期HTS疾病提供新的指導方向。

1? 材料

1.1 藥品及主要試劑：全蝎軟膏為黑龍江中醫(yī)藥大學附屬二院院內制劑;蘇木精-伊紅染色液、PBS磷酸鹽緩沖液，購自Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司;兔Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、兔Ⅲ型膠原蛋白（Col Ⅲ）酶聯(lián)免疫試劑盒、兔腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;反轉錄試劑盒、SYBR qPCR Mix試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司;兔抗人Smad4單克隆抗體、兔抗人GAPDH 單克隆抗體，購自武漢菲恩生物科技有限公司;HRP標記羊抗兔二抗，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 主要儀器：萊納半導體激光治療儀（LHH-500IVB）購自上海醫(yī)康儀器有限公司;顯微鏡（DM 2 000）購自奧林巴斯株式會社;酶標儀（Multiskan FC）、低溫離心機、電子天平、Western blot檢測分析儀，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;高壓蒸汽滅菌器（MLS-3751L-PC），購自松下電器（中國）有限公司;渦旋混合儀器（XW-80A）、移液器等，購自德國Eppendorf公司;Real-time PCR儀（CFX96），購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司;超微量分光光度計（K5 600），購自上海昂拉儀器有限公司。

1.3 實驗動物：清潔級新西蘭大白兔體重為2.5～3.5kg，共20只，購自遼寧長生生物技術有限公司。飼養(yǎng)于黑中醫(yī)附屬二院的實驗動物中心，購入后調整性飼養(yǎng)1周，環(huán)境條件為（25±1）℃、濕度為55%～65%，飲食、進水均自由。

2? 方法

2.1 兔耳增生性瘢痕模型的建立及治療：將16只新西蘭大白兔分隨機分為四組：對照組（4只）、模型組（4只）、全蝎軟膏組（4只）和聯(lián)合組（半導體激光聯(lián)合全蝎軟膏組，4只），參考Uzun H等瘢痕建立方法[13]。除對照組外，分別用20% 烏拉坦劑量為5.0ml/kg耳緣靜脈注射，對實驗動物進行麻醉，兔耳部皮膚經(jīng)75%酒精消毒后避開可見血管，在左右耳沿中線兩側分別作6個直徑為8mm大小圓形皮膚缺損創(chuàng)面，用手術刀切除兔耳全層皮膚，刮除軟骨膜，保留軟骨，出血點壓迫止血，每兩個創(chuàng)面之間間隔1cm。術后按表1方案直接對患處進行相應的連續(xù)治療50d，其中，激光治療儀照射參數(shù)為：激光波長980nm，激光輸出功率為2 800mW，能量密度為10mJ/cm2，記錄兔耳瘢痕形態(tài)變化。

2.2 動物標本的采集：治療50d后，無菌條件下切取各試驗組兔耳瘢痕對應部位組織，一部分用10%的甲醛溶液進行固定，石蠟包埋后用于病理檢測;另一部分儲存于-20℃冰箱中備用，留作ColⅠ蛋白、ColⅢ蛋白及兔TNF-α的ELISA檢測、熒光定量PCR和Smad4蛋白的Western blot檢測。

2.3 HE染色：將固定和包埋的各實驗組兔耳組織切成厚度約為5μm的組織切片，置于載玻片上65℃作用4h;按照蘇木素-伊紅染色液說明書所述，經(jīng)蘇木精染液2min、反藍液作用3min、伊紅染色液1min、梯度酒精脫水后風干、中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察并拍攝。

2.4 瘢痕組織的ELISA檢測：將對照組、模型組、全蝎軟膏組和聯(lián)合組的組織用PBS緩沖液（0.01M， pH=7.4）沖洗4次，棄殘留液后晾干;將組織剪碎與一定體積的PBS置于玻璃勻漿器中，于低溫下充分研磨，將勻漿于10 000×g離心3min取上清液，經(jīng)測定濃度后備用。按照兔Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）酶聯(lián)免疫試劑盒、兔Ⅲ型膠原蛋白（Col Ⅲ）酶聯(lián)免疫試劑盒、兔腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒內的說明書所述進行操作，分別設置標準孔和樣本孔的ELISA檢測，反應終止后在450nm波長處檢測各孔的OD值并記錄。

2.5 Real-time PCR檢測：取各實驗組組織約0.5g放入EP管中，按照RNA提取試劑盒說明書提取組織內RNA，取1μl提取液于蛋白分析儀測定含量及純度;按照反轉錄試劑盒說明書所述配置總反應為10μL反轉錄體系，置于PCR以上按37℃ 15min，98℃ 5min，4℃ 30min程序進行反轉錄，反應后將cDNA定量至100ng/?l。隨后，配制體積為20μl的real-time PCR反應體系：SYBR qPCR Mix 10μl，上游/下游引物各 1μl，滅菌去離子水 7μl，cDNA 1μl;反應條件如下：95℃ 3min預變性，95℃ 10s、95℃ 5s、60℃ 30s，共40個循環(huán)并于60℃下充分延伸10min，real-time PCR引物見表2，反應結束后導出并整理數(shù)據(jù)。

2.6? Western blot檢測：對上述提取的組織上清液以考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，取20μl上清液經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳作用后轉至PVDF膜上;同時，設定甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）蛋白為內參分別經(jīng)Smad單克隆抗體及1：2 000 HRP標記羊抗兔二抗孵育，經(jīng)ECL發(fā)光顯色條帶并將結果使用Western blot圖像系統(tǒng)處理分析。

2.7 統(tǒng)計學分析：統(tǒng)計學數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進行分析，以x?±s表示，采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3? 結果

3.1 瘢痕模型的形態(tài)觀察：在增生性瘢痕模型建立后立即對患處進行用藥處理，并連續(xù)治療50d。與模型組相比，聯(lián)合組的治療效果最為顯著，可于治療后的第35d觀察到增生性瘢痕消失，且皮膚表面愈合速度較快;而全蝎軟膏組經(jīng)涂抹治療后皮膚表面愈合速度較前者緩慢，經(jīng)50d治療后皮膚表面的瘢痕逐漸消失，見圖1。

3.2 HE染色觀察結果：HE染色結果顯示，模型組在鏡下觀察可見增皮層增厚，大量成纖維細胞聚集、細胞外間質內膠原沉積，且毛細血管炎癥細胞浸潤;而激光聯(lián)合全蝎軟膏組觀察可見，無血管炎癥和炎性細胞出現(xiàn)，組織中成纖維細胞和膠原蛋白分布程度與空白對照組類似，而全蝎軟膏組組織內則出現(xiàn)較輕的成纖維細胞聚集和少量膠原沉積，且血管增生較輕微，表明激光聯(lián)合全蝎軟膏可明顯改善瘢痕組織病理結構，見圖2。

3.3 瘢痕組織中膠原蛋白及腫瘤壞死因子檢測結果：ELISA檢測結果表明，模型組瘢痕組織中ColⅠ膠原蛋白、Col Ⅲ膠原蛋白及腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達量均顯著升高;而經(jīng)全蝎軟膏組和激光聯(lián)合全蝎軟膏組連續(xù)治療50d后，ColⅠ蛋白、ColⅢ蛋白和TNF-α因子均有不同程度降低，聯(lián)合組的治療效果較單獨使用全蝎軟膏組的治療效果顯著，膠原蛋白和TNF-α的含量與對照組相接近，而全蝎軟膏組內膠原蛋白和TNF-α的表達量高于對照組，表明激光聯(lián)合全蝎軟膏方法可以顯著降低瘢痕組織中膠原蛋白和腫瘤壞死因子的表達水平（P<0.05），見圖3。

3.4 Real-time PCR檢測結果：Real-time PCR擴增結果如圖4所示，與對照組和模型組相比，全蝎軟膏組與聯(lián)合組的組織內MMP含量均有不同程度的升高，其中聯(lián)合組MMP上升最顯著（P<0.05）;而聯(lián)合組中ColⅠ型膠原蛋白、ColⅢ型膠原蛋白的表達量與其他各組相比顯著降低（P<0.05），表明全蝎軟膏可以通過影響皮膚組織內的MMP大量合成，從而抑制成纖維細胞的過量表達，同時抑制膠原蛋白在細胞外間質內大量沉積以阻止增生性瘢痕的形成，見圖4。

3.5 全蝎軟膏對兔耳增生性瘢痕組織中Smad 4蛋白表達的影響：對連續(xù)治療50d后的瘢痕組織進行Western blot檢測，結果顯示，未經(jīng)治療的模型組瘢痕組織中Smad 4蛋白量表達顯著升高，而兩個治療組瘢痕組織中Smad 4蛋白水平較模型組均顯著降低（P<0.05）。激光聯(lián)合全蝎軟膏治療后的瘢痕組織中的Smad 4蛋白含量明顯降低，而全蝎軟膏組次之，提示激光聯(lián)合全蝎軟膏的方法可以顯著抑制瘢痕生長并通過降低Smad 4蛋白的表達水平，從而影響TGF-β信號通路的轉導，見圖5。

4? 討論

增生性瘢痕多因“氣滯血瘀，余毒未散”，寒邪長時間客于機體經(jīng)脈之中，氣血運行失常致使機體出現(xiàn)不同程度的氣滯血凝現(xiàn)象，久之則形成瘢痕[14]。增生性瘢痕雖不危及生命，但會在不同程度上對患者的生活質量造成影響，如外表美觀、肢體疼痛及瘙癢等，嚴重者甚至影響關節(jié)功能，因此，及時、合理、正確地治療增生性瘢痕疾病對恢復患者的身心健康有著重要的積極意義。我國傳統(tǒng)醫(yī)學對增生性瘢痕的防治歷史悠久，臨床常見的治療手段主要以中草藥和針灸較為常見，如：丹參、三七、積雪草和川芎等，并已取得了良好治療效果[4，15]。

目前，對于增生性瘢痕的發(fā)病機理尚未明確，選擇療效好、費用低、副作用小的中成藥仍是治療瘢痕性疾病的重要手段。已有許多學者報道并證實了積雪苷霜軟膏因具有清熱利濕和祛腫消炎等藥效，能夠對增生性瘢痕疾病起到抑制和治療作用[16-17]。而本研究選取的全蝎軟膏因含有獨特的組份（全蝎、蜈蚣、冰片），使其具有清熱解毒、活血化瘀、祛腐生肌及抑菌消炎等功效[18]，被認為是用于治療瘢痕疾病的潛在用藥。因此，本研究通過建立兔耳增生性瘢痕病理模型，以激光療法聯(lián)合全蝎軟膏對早期增生性瘢痕疾病進行觀察研究。研究結果表明，單獨使用全蝎軟膏和激光聯(lián)合全蝎軟膏方法治療均能夠在不同程度上治療增生性瘢痕，但激光輔助療效更佳，HE染色和ELISA檢測結果可見，激光聯(lián)合全蝎軟膏療法可顯著降低組織中成纖維細胞和膠原細胞（ColⅠ型、ColⅢ型）沉積，改善毛細血管內炎癥細胞浸潤，同時降低TNF-α因子的表達量，與模型組相比差異性顯著（P<0.05）。這一研究結果表明全蝎軟膏主要通過抑制成纖維細胞增殖、細胞外基質膠原蛋白沉積和降低TNF-α因子表達來抑制增生性瘢痕的形成。

隨著對增生性瘢痕疾病的深入研究，已在分子和基因水平上證實了TGF-β-smads信號通路、PI3K/Akt通路和MAPK細胞外通路可參與瘢痕的形成[19]，本研究選擇的Smad 4蛋白是TGF-β受體下游信號蛋白。Western blot結果顯示，經(jīng)激光聯(lián)合全蝎軟膏治療后的組織中Smad 4蛋白表達量較模型組顯著降低（P<0.05），表明Smad 4蛋白作為TGF-β受體的下游信號蛋白，以正向反饋調節(jié)的形式阻斷成纖維細胞內TGF-β信號通路傳導，從而抑制增生性瘢痕的形成。此外，考慮到全蝎軟膏自身的藥物特性并兼顧達到治療早期增生性瘢痕的目的，本研究在兔耳增生性瘢痕模型建立后直接以激光照射輔助全蝎軟膏對患處進行治療，經(jīng)藥物治療35d后，患處皮膚及可恢復至術前水平，并無增生性瘢痕出現(xiàn)，證明了全蝎軟膏作為一種副作用小、安全性好的中藥制劑對早期瘢痕具有良好的治療效果，值得在臨床上應用和推廣。

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[收稿日期]2019-08-22

本文引用格式：王景，張海麗，滕林，等.激光聯(lián)合全蝎軟膏治療增生性瘢痕療效評價[J].中國美容醫(yī)學，2020，29（6）：27-31.