固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料工藝的研究

江成英，劉曉蘭，王 松

（1.梧州學院化學工程與資源再利用學院，廣西梧州 543000；2.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

玉米黃粉也稱玉米蛋白粉，是加工玉米淀粉的副產(chǎn)物之一。玉米蛋白粉中的蛋白質(zhì)有兩種狀態(tài)，即可溶性蛋白質(zhì)和不可溶性蛋白質(zhì)，不溶性蛋白質(zhì)容易和其他的大分子有機物或微量元素結(jié)合，而不易被身體吸收，幾乎均被排出體外（ 趙文揚等，2014）。玉米蛋白粉因不溶性蛋白質(zhì)含量較高及氨基酸組成極不平衡，利用價值及營養(yǎng)品質(zhì)較低，嚴重制約其在飼料中的應用（佟維娜等，2017；晏家友等，2009；王冠禹等，2008）。對玉米蛋白粉進行加工處理，充分發(fā)掘其潛在價值，既可節(jié)約能源，又能夠促進玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展（陸啟明等，2018；李麗等，2010）。

利用微生物發(fā)酵可提高玉米蛋白粉飼料的利用率（江成英，2018）。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶類能夠?qū)⒌鞍追壑须y以被吸收利用的植物大分子蛋白質(zhì)降解為分子質(zhì)量較小的多肽、 小肽或游離氨基酸，從而改善玉米蛋白粉的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生具有多種生理活性的肽類，增強動物免疫力（魏炳棟，2017）。本研究以玉米黃粉為主要原料，以多菌種組合制備的種曲為發(fā)酵劑進行發(fā)酵飼料的制備，在單因素試驗的基礎上，采用四因素三水平的正交試驗，旨在優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 主要材料 種曲：本項目組制備；玉米黃粉：中糧生化能源（龍江）有限公司提供；麩皮：市售。

1.2 主要試劑 碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、鹽酸、硫酸鋰、液溴、葡萄糖、瓊脂、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母粉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），顯微鏡（寧波永新光學股份有限公司），手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），紫外可見分光光度計（日本島津儀器廠），移液器 （北京青云卓立精密設備有限公司），數(shù)顯pH 計（上海精密科學儀器有限公司），超凈工作臺（上海智城分析儀器有限公司），電子天平（北京賽多利斯儀器廠）等。

1.4 試驗方法

1.4.1 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 采用福林酚法測定可溶性蛋白質(zhì)含量（王永華，2010）。

1.4.2 種曲的制備 將枯草芽孢桿菌、熱帶假絲酵母菌、嗜熱乳桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌按3:3:1:4:2 比例混合，以5%的接種量接入料水比為 1：1.6、物料比（黃粉：麩皮）為 4：6 滅菌的培養(yǎng)基上，在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)84 h （江成英，2018）。

1.4.3 單因素試驗 將玉米黃粉與麩皮以一定比例混合制備發(fā)酵培養(yǎng)基，接種種曲進行固態(tài)發(fā)酵，以發(fā)酵過程中可溶性蛋白質(zhì)含量為指標進行發(fā)酵條件的確定。本試驗在飼料的制備過程中主要研究了物料比、料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。

1.4.4 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，對料水比、接種量、發(fā)酵時間以及發(fā)酵溫度設計四因素三水平 L9（34） 的正交優(yōu)化試驗，以確定固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的工藝條件。

1.4.5 發(fā)酵驗證試驗 對正交試驗獲得的最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響首先發(fā)酵時間進行單因素優(yōu)化試驗，發(fā)酵條件為黃粉：麩皮=7：3，料水比為 1：1.2，種曲的接種量為5%，發(fā)酵溫度為30 ℃。48 h 以后每隔12 h檢測發(fā)酵底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量。可溶性蛋白質(zhì)含量及蛋白轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵時間變化的關(guān)系如圖1 所示。

圖1 發(fā)酵時間對可溶性蛋白含量的影響

如圖1 所示，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量不斷增加，當時間為96 h時達到最大值10.85%。超過96 h 以后，可溶性蛋白質(zhì)含量有所下降，在120 h 以后可溶性蛋白質(zhì)含量又略有提高。這主要是由于發(fā)酵前期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)充足菌群大量繁殖，產(chǎn)蛋白酶能力迅速提高，從而使發(fā)酵底物中非水溶性蛋白質(zhì)不斷轉(zhuǎn)化，隨著菌種量的增加，消耗發(fā)酵底物中營養(yǎng)速度也不斷增大；到了發(fā)酵后期發(fā)酵底物中的營養(yǎng)物質(zhì)已不能滿足菌群生長及產(chǎn)蛋白酶的需求，因此菌群產(chǎn)蛋白酶活力降低，進而可溶性蛋白質(zhì)含量下降，超過120 h 之后一些菌體的自溶使得可溶性蛋白質(zhì)含量略有升高。綜合考慮，確定96 h為最佳的發(fā)酵時間。

2.1.2 發(fā)酵溫度對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在黃粉：麩皮=7：3，料水比為 1：1.2，種曲的接種量為5%，發(fā)酵時間為96 h 條件下對發(fā)酵溫度進行了優(yōu)化試驗，設置了 28、30、32、34 ℃四個溫度梯度，每個梯度設置三個平行樣，發(fā)酵結(jié)束后，通過福林酚法檢測可溶性蛋白質(zhì)含量并計算蛋白轉(zhuǎn)化率，從而確定發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的最佳發(fā)酵溫度。結(jié)果如圖2 所示。

圖2 發(fā)酵溫度對可溶性蛋白含量的影響

由圖2 可知，各溫度梯度對發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響不明顯，主要原因可能是在28～34 ℃都能適用于蛋白酶發(fā)揮催化活力，但在32 ℃時發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)最高，為11.41%，故確定發(fā)酵溫度為32 ℃。

2.1.3 物料比對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在料水比為1：1.2，種曲的接種量為5%，發(fā)酵時間為96 h，發(fā)酵溫度為32 ℃的條件下，設置了黃粉：麩皮為 4：6、5：5、6：4、7：3、8：2 五個梯度來研究物料比對發(fā)酵飼料中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果如圖3 所示。

圖3 物料比對可溶性蛋白含量的影響

從圖3 可以看出，隨著物料中玉米蛋白粉含量的增加，發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸升高，至黃粉：麩皮為7：3 時達到最高，為11.43%。而再增加玉米蛋白粉的含量反而使可溶性蛋白質(zhì)含量有所下降。這主要是由于碳氮比降低時菌種產(chǎn)蛋白酶能力較強，從而使水溶性蛋白質(zhì)水解率增大，但玉米蛋白粉過多會導致發(fā)酵底物透氣性差，使微生物生長受限而影響蛋白酶的產(chǎn)量，進而使可溶性蛋白質(zhì)含量下降。因此，確定最適物料比黃粉：麩皮為 7：3。

2.1.4 接種量對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在料水比為 1：1.2，物料比（黃粉：麩皮）為 7：3，發(fā)酵時間為96 h，發(fā)酵溫度為32 ℃的條件下，對種曲的接種量進行了優(yōu)化，每組三個平行樣，可溶性蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果如圖4 所示。

圖4 接種量對可溶性蛋白含量的影響

由圖4 可知，種曲的接種量增加時底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量隨之增加。當種曲接種量為5%時，底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量為11.42%。但當接種量超過5%時，底物的可溶性蛋白質(zhì)含量增加不大，從生產(chǎn)成本考慮選取接種量5%為發(fā)酵飼料種曲的接種量。

2.1.5 料水比對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在物料比（黃粉：麩皮）為 7：3，發(fā)酵時間為 96 h，發(fā)酵溫度為32 ℃，種曲的接種量為5%的條件下，對物料的料水比進行了優(yōu)化，設置了 1：1、1：1.2、1：1.4、1：1.6 四個梯度，每組三個平行樣，發(fā)酵結(jié)束后檢測可溶性蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 料水比對可溶性蛋白含量的影響

由圖5 可以看出，隨著物料中加水量的逐漸增多，可溶性蛋白質(zhì)含量隨著增加，料水比為1:1.4 時，可溶性蛋白質(zhì)含量最高，為13.08%。說明在此條件下，培養(yǎng)基中的含水量既可以滿足菌體生長的需要，又不會影響物料的發(fā)酵，是一個較為理想的比例。

2.2 正交試驗結(jié)果分析 通過單因素試驗得出，固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的條件為物料比（黃粉：麩皮）7：3，發(fā)酵時間 96 h，發(fā)酵溫度 32 ℃，種曲的接種量5%，料水比1：1.4。在此基礎上設計了四因素三水平L9（34）的正交試驗，對各因素組合進行優(yōu)化。正交試驗設計和試驗結(jié)果如表1 所示。

表1 正交試驗設計與結(jié)果

由表1 分析可以看出，固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的最佳條件為A2B2C3D3，即料水比為1:1.4，接種量為5%，發(fā)酵溫度為33 ℃，發(fā)酵時間為108 h。

2.3 發(fā)酵驗證試驗結(jié)果 將玉米黃粉與麩皮以7:3 的比例混合，按 1.4 的比例（g/mL）加入水，混勻后于121 ℃蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫，接入5%的種曲，置于33 ℃條件下108 h，測定其中可溶性蛋白質(zhì)含量為13.67%。

3 結(jié)論

本研究通過正交試驗確定了固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的工藝條件為物料比（黃粉：麩皮）7：3，料水比 1：1.4，發(fā)酵時間 108 h，發(fā)酵溫度 33 ℃，種曲接種量5%。該條件下發(fā)酵玉米黃粉飼料中可溶性蛋白質(zhì)含量為13.67%。