不同鹽度下脊尾白蝦proPO 和SOD 基因表達及其酶活力分析

許振山， 張 靜， 張偉麗， 梁俊平，， 李 健， 李吉濤

（1. 河南師范大學水產學院，河南 新鄉453007；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室，山東 青島266071）

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)是一種小型經濟蝦類，廣泛分布于中國沿海和朝鮮半島西岸的淺海水域，生長速度快，適應性廣[1-2]，特別是對鹽度具有較強的適應性，在河口及淺海區域均可正常生存，甚至通過逐漸淡化可在淡水中生存[3]。梁俊平等[4]研究發現，脊尾白蝦在5-30鹽度下，可正常抱卵、孵化，但在不同鹽度下，子代生長速度差異顯著，其最適生長鹽度為20，在此鹽度下Na+-K+-ATPase mRNA表達量也最低，可能是在此鹽度下，滲透壓調節耗能較小，更多的能量用于了生長。研究表明，鹽度不僅會影響甲殼動物生長、繁殖，而且會影響甲殼動物免疫防御能力。Wang等[5]研究發現，當凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）從鹽度為25的水體中轉移到鹽度為5和15的水體中后，其酚氧化酶（phenofoxidase，PO）活力均有所下降，而轉移到35的水中，其PO活力顯著增加。葉建生等[6]研究也發現，鹽度突變對凡納濱對蝦免疫酶活有顯著影響，當從鹽度30突變到27、24、21等不同鹽度后，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）酶活力顯著降低。王瑞芳等[7]對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）急性鹽度脅迫后發現，PO活力隨鹽度逐漸升高呈顯著下降趨勢。由此可見，急性鹽度變化對甲殼動物免疫力有重要影響。

李玉全、李洋等[8-10]對脊尾白蝦急性鹽度脅迫后發現，無論是高鹽度突降到低鹽度或是低鹽度驟升到高鹽度，都會對SOD、PO活力產生負面影響。那么，對于長期生活在不同鹽度水體中脊尾白蝦，其生長速度與其免疫力是否存在某種相關性？本研究選擇長期生活在不同鹽度下的脊尾白蝦，比較了不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO和SOD基因表達及其酶活力水平，以期為不同鹽度水域脊尾白蝦健康養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

性成熟脊尾白蝦親蝦經逐漸淡化后，養殖于鹽度30、25、20、15、10、5水體中，在此6個鹽度下交尾抱卵，直至幼體孵化，并繼續培育。本實驗選取不同鹽度下生長的幼蝦，養殖于200 LPVC桶，水溫18℃，充氣。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣及樣品處理

每個鹽度設3個重復，每個重復取5尾脊尾白蝦，迅速解剖取肝胰腺置入1.5 mL無RNA酶離心管，放入液氮冷凍。之后將肝胰腺放入研缽，加液氮研磨成粉末，一部分研磨樣品轉移至離心管，加入預冷PBS 緩沖溶液，漩渦震蕩，4℃800×g離心10 min，吸取上清液，置-80℃保存用于酶活力測定。取另一部分研磨樣品轉至1.5 mL無RNA酶離心管(內含1.0 mL TRIzol液)，漩渦震蕩，置-80℃保存用于總RNA提取。

1.2.2 酶活力測定

采用試劑盒（南京建成生物工程研究所生產）測定SOD活性，采用改進的Ashida方法和雷質文等[12]方法測定PO活性。

1.2.3 proPO基因和SOD基因表達分析

采用Trizol法提取脊尾白蝦肝胰腺RNA，用MOPS瓊脂糖電泳檢測總RNA的完整性，按照M-MLV反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。根據GenBank中脊尾白蝦proPO基因和SOD基因序列，分別設計熒光定量特異引物，內參基因為actin，所用引物如表1所示。利用熒光定量PCR對不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO基因和SOD基因的表達量進行檢測，每個樣品3個重復。PCR反應體系及擴增程序按照SYBR Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)試劑盒說明書進行。所得實驗數據采用2-△△CT法計算各基因的相對表達量。

1.3 統計分析

各鹽度下酶活力和基因表達量以平均值±標準差（X±SD）表示，采用SPSS16.0軟件中單因子方差分析(one-way-ANOVA)檢驗顯著性差異(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO基因表達量和PO活力變化

如圖1所示，隨著鹽度升高，脊尾白蝦肝胰腺proPO基因表達量呈現先升高后降低趨勢，鹽度15和20兩組間的proPO基因表達量無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于其它鹽度組的表達量（P＜0.05）。脊尾白蝦肝胰腺PO活力也呈現先升高后降低趨勢，鹽度15 和20 兩組間的酶活力無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于其它鹽度組的酶活力（P＜0.05）（圖2）。

圖1 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO基因表達量變化Fig.1 Effect of salinity on proPO mRNA levels of E. carinicauda

圖2 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺PO活力Fig.2 Effect of salinity on PO activities of E. carinicauda

2.2 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺SOD基因表達量和SOD活力變化

如圖3所示，隨著鹽度升高，脊尾白蝦肝胰腺SOD基因表達量呈現先升高后降低趨勢，鹽度15和20時的SOD基因表達量顯著高于其它鹽度組基因表達量（P＜0.05）；肝胰腺SOD活力變化趨勢與其基因表達趨勢相同（圖4）。

圖3 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺SOD基因表達量變化Fig.3 Effect of salinity on SOD mRNA levels of E. carinicauda

圖4 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺中SOD活力Fig.4 Effect of salinity on SOD activities of E. carinicauda

3 討論

3.1 不同鹽度下脊尾白蝦proPO基因表達量及PO活力變化

酚氧化酶（phenofoxidase，PO）在甲殼動物的非特性免疫反應中發揮著重要識別和防御作用[13]。一般情況下，PO以無活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase，proPO)形式存在，β-1，3-葡聚糖（β-1，3-G）、脂多糖、胰蛋白、加熱、Ca2+濃度下降等都可以激活proPO系統，引發酶級聯反應，生成有活性的PO[8]，對病原體起到抑制作用或殺死病原體，從而可降低微生物對宿主的感染幾率[8-14]。本研究顯示，長期生活在不同鹽度水體中的脊尾白蝦，PO活力隨著鹽度升高均呈現先升高后降低趨勢，在鹽度15和20時的酶活力顯著高于其它鹽度組，同時proPO基因mRNA表達量也呈現相似趨勢。前期研究發現，脊尾白蝦在鹽度17.5左右表現出最快生長速度[4]，與PO活力變化趨勢基本一致。這說明在此鹽度下，脊尾白蝦proPO系統可被有效激活，以提高自身免疫力應對環境變化。

當凡納濱對蝦從鹽度為25的水體中轉移到鹽度為5和15的水體中后，其PO活力均有所下降，而轉移到35的水中，其PO活力有所增加[5]，說明不適鹽度降低了凡納濱對蝦的免疫力。在中華絨螯蟹研究中也發現，與淡水組相比，隨著鹽度逐漸升高，中華絨螯蟹雄蟹PO活力呈顯著下降趨勢[15]。而當凡納濱對蝦仔蝦養殖在鹽度2.5、5、15、25、35水體中24周后，鹽度15、25、35時PO活力顯著高于鹽度為2.5和5 的活力；通過溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和WSSV感染后發現，鹽度15、25、35時的死亡率顯著低于鹽度為2.5和5的死亡率，研究認為凡納濱對蝦在低鹽度下抗病力降低與體內PO活力降低有關[16]。本實驗結果與上述研究結果相一致，說明PO酶活力可作為評價脊尾白蝦不同鹽度下免疫力強弱的指標。李洋等[8]研究顯示，不同鹽度急性脅迫后，低鹽度下脊尾白蝦proPO基因表達量在短時間內顯著高于高鹽度組，而當脅迫48 h后，各鹽度下proPO基因表達量趨于穩定且無顯著性差異，與本實驗結果有相似之處，但也有一定差別。可能是由于不同實驗所選實驗動物生活環境不同所導致，李洋等[8]所選的脊尾白蝦為生活在鹽度32的成蝦，對鹽度適應性較強，短時間內對鹽度變化導致免疫酶活變化顯著，而后適應了各鹽度條件。而本實驗所選脊尾白蝦幼蝦為在各鹽度下孵化而來，從幼體階段一直生活在其各自鹽度環境條件下，其免疫酶活是各鹽度下長期適應下的反映。

3.2 不同鹽度下脊尾白蝦SOD基因表達量及其酶活力變化

SOD是機體內重要的的抗氧化酶之一，可以阻斷因自由基造成的細胞損傷，并及時修復損傷細胞，在抗氧化方面發揮重要的生理作用[17]。在凡納濱對蝦成蝦中研究發現，當鹽度從30突變到27、24、21等低鹽度后，鹽度突變組SOD活性顯著低于對照組[6]。當鹽度從12驟降到8或5時，凡納濱對蝦仔蝦SOD活性也顯著降低[18]。李玉全等[10]研究發現，當鹽度從33降低到5或升高至45 時，都會對脊尾白蝦SOD活力產生負面影響，而對照組鹽度33時的SOD 活力維持在最高水平。由此可見，當甲殼動物處于最佳生活環境下，其免疫力也最強，而環境突變可能會顯著影響其免疫力。本研究顯示，長期生活在不同鹽度水體中的脊尾白蝦，SOD活力隨著鹽度升高均呈現先升高后降低趨勢，在鹽度15和20時的酶活力顯著高于其它鹽度組，SOD基因mRNA表達量也呈現相似趨勢。梁俊平等[4]研究發現，脊尾白蝦在鹽度17.5左右表現出最快生長速度；姜巨峰等[19]也發現，脊尾白蝦在鹽度15、20時的特定生長率顯著高于其它鹽度組。說明脊尾白蝦在鹽度15-20時表現出最快生長速度與其具有較強免疫力密切相關。