TGF-β1參與調控LMP1介導信號轉導通路研究

姚曉媛，宋曉環，王忠超，鐘志偉

(長春醫學高等專科學校，長春 130031)

EB病毒(EBV)不僅是單核細胞增多癥的一個病原體，也是一個比較重要的DNA腫瘤病毒，與T/B淋巴細胞瘤、何杰金病以及鼻咽癌等多種腫瘤的發生和發展有關。而潛伏膜蛋白1(LMP1)作為EBV的一個致瘤蛋白，能夠在體外向成纖維細胞轉化，具有抑制細胞分化、細胞凋亡以及介導細胞增殖的功能，與NPC低分化有關，并且可以對腫瘤的轉移和侵襲起到一定的促進作用[1]。而轉化生長因子-β1(TGF-β1)可以調控細胞的分化和生長，并且腫瘤的發生和發展與其傳導紊亂和表達異常有關。本研究對LMP1介導信號轉導通路中TGF-β1的參與作用進行了研究，報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞系

本研究細胞系包括HCG-27和SCG-7901為EBV陰性胃癌細胞系、SNU719陽性胃癌細胞系。其中，培養液為鏈霉素100 mg/L、青霉素100 kU/L以及胎牛血清，并且按照常規方法培養細胞。

1.2 主要試劑

研究試劑包括TGF-β1、逆轉錄試劑盒、脂質體轉染試劑以及RNA提取試劑。

1.3 方法

1.3.1 siRNA649轉染

GT38為表達LMP1的EVB陽性細胞系分為5組，分別是TGF-β1處理組、siRNA649+TGF-β1處理組、siRNA649處理組、Lip2000對照組以及細胞對照組。其中，TGF-β1處理組運用70%～80%細胞匯合度的單層細胞，將培養液去掉后，運用PBS液進行2次洗滌，然后將DMEM培養液加入繼續培養。而siRNA649處理組轉染前1 d，運用無抗生素培養基對GT38細胞進行培養，待細胞匯合度為30%～50%時，運用脂質體法以50 nmol/L的濃度將特異性siRNA649轉染為GT38細胞。同時，TGF-β1+siRNA649處理組轉染后，將濃度為10 mg/L的TGF-β1加入進行處理。上述各組經過48 h作用后，將培養液棄去，運用胰蛋白酶對細胞進行收集，運用PBS對細胞進行2次洗滌，并運用TRIzol一步法對細胞總RNA進行提取。

1.3.2 檢測轉錄水平

選擇細胞總RNA為模板，根據逆轉錄試劑盒要求，將cDNA合成進行PCR擴增，根據參照文獻設計內參照基因GAPDH、LCAM-1、EGFR、CDK4、Survivin、MMP9以及LMP1的引物，并且運用凝膠成像系統對電泳結果進行分析。

2 結果

2.1 siRNA649轉染后LMP1 mRNA的轉錄表達

采用50 nmol/L終濃度siRNA649對GT38細胞進行轉染，待48 h后，對各組細胞總RNA進行提取，并運用RT-PCR對LMP1 mPRN轉錄表達進行檢測。結果顯示，LMP1 mRNA轉染后表達缺失，見圖1。

2.2 TGF-β1對不同因子轉錄表達的影響

TGF-β1作用HCG-27、SGC7901、SNU719以及GT38細胞系48 h后，GT38細胞系ICAM-1的表達明顯低于對照組(P<0.05)，但是在其他細胞中表達比較無差異(P>0.05)。同時，TGF-β1作用前后，4種細胞系的表達對比無統計意義(P>0.05)，見表1。

圖1 RT-PCR檢測的轉錄表達

表1 各組的轉錄表達灰度值

3 討論

EBV作為人類的一個腫瘤病毒，其與上皮細胞和淋巴細胞源性腫瘤的發生有關，而LMP1編碼基因作為公認的一個病毒癌基因。本研究發現，在EBVaGC的發生和發展中，LMP1發揮著極其重要的作用。MMPs作為ECM降解的一個重要酶類，多種惡性腫瘤的轉移與其過度表達有關，并且在上皮細胞中，LMP1能夠對MMP9表達發揮一定的誘導作用[2]。Survivin作為凋亡抑制的一種蛋白，可以促進細胞增殖，對細胞凋亡進行抑制，調節細胞有絲分裂，并且對腫瘤轉移和生長起到一定的促進作用[3]。本研究發現，升高CDK4 mRNA表達后，可下調Survivin轉錄表達，并且LMPI能夠利用AP-1信號轉導通路對Survivin表達進行調節，從而參與EBV相關腫瘤的發生和發展。同時，LMP1能夠活化NF-κB和磷酸化ERK1/2，對TGF-β1調控生長進行抑制，并且TGF-β1對GT38細胞系產生直接作用后，還能明顯降低ICAM-1表達。

綜上所述，LMP1沉默后能夠對ICAM-1、Survivin以及MMP9表達進行抑制，有助于CDK4表達，并且LMP1與TGF-β1參與介導的ICAM-1表達有關。