生防細(xì)菌ML-3抗菌蛋白穩(wěn)定性研究

李靜舒　趙佳

摘 要：為確定ML-3表達(dá)的抗菌蛋白在不同外部環(huán)境下的穩(wěn)定性，本研究采用不同溫度、pH、紫外光照時(shí)間、金屬離子、蛋白酶處理，對(duì)ML-3抗菌蛋白抑菌性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：該抗菌蛋白在低于60℃、pH5～8、紫外光照24h下可以保持較高抑菌活性;對(duì)Cu2+和Mg2+敏感，對(duì)Na+、K+、Zn2+和Fe2+不敏感;對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，對(duì)蛋白酶K不敏感。提示ML-3抗菌蛋白在田間生物防治中具有一定應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：ML-3抗菌蛋白;溫度;pH;紫外光照;金屬離子;蛋白酶

中圖分類號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

細(xì)菌侵染類型的病害具有種類多、分布廣、危害重的特點(diǎn)，嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)發(fā)展。馬鈴薯早疫病（Alternarin solani Sorauer）是制約馬鈴薯正常發(fā)育的真菌病害之一，其是由鏈格孢屬的茄鏈格孢菌（Alternaria solani）引起，主要發(fā)生在植株的葉部和塊莖，危害性僅次于晚疫病[1]。這種病害高發(fā)于馬鈴薯主要種植區(qū)，嚴(yán)重影響生產(chǎn)，降低馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量，還有可能導(dǎo)致大范圍內(nèi)病害流行。目前農(nóng)業(yè)上主要采用化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治菌物病害[2]。但是，這種以化學(xué)性農(nóng)藥為主的密集型殺害方法，不僅會(huì)使病害對(duì)藥劑產(chǎn)生抗藥性，還會(huì)破壞農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)人類健康造成影響[3]，采用生物防治的方法來(lái)減少化學(xué)農(nóng)藥的投入是發(fā)展的趨勢(shì)。

山西省農(nóng)科院生物技術(shù)中心曾從馬鈴薯莖部分離篩選出了1株馬鈴薯早疫病拮抗菌株ML-3。本研究旨在確定ML-3表達(dá)的抗菌蛋白在不同外部環(huán)境下的穩(wěn)定性，評(píng)價(jià)該抗菌蛋白在田間的適用可能性，進(jìn)而為開(kāi)發(fā)抗馬鈴薯早疫病的生物農(nóng)藥提供思路，為生物防治作物病害方面的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)基

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

ML-3拮抗菌株和馬鈴薯早疫病病原菌，由山西農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保存和提供。

1.1.2 供試細(xì)菌培養(yǎng)基質(zhì)

參照高振峰[4]的方法配制培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株ML-3的活化

菌株ML-3（-80℃冰箱凍存）解凍后，取50μL懸浮液，用接種環(huán)接種到新鮮配制的NA平板上，于30℃下恒溫培養(yǎng)48h。

1.2.2 馬鈴薯早疫病病原菌活化

用接種環(huán)少量挑取馬鈴薯早疫病病原菌，接種到新配制的PDA平板上，于30℃下溫箱恒溫培養(yǎng)3d;待菌落直徑長(zhǎng)到約1.5cm左右時(shí)，挑取菌絲轉(zhuǎn)接到新配制PDA平板上，于30℃下溫箱恒溫培養(yǎng)7d，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。

1.2.3 菌株ML-3的發(fā)酵液制備

將活化培養(yǎng)48h后的菌株ML-3置于超凈臺(tái)內(nèi)，用接種環(huán)挑取一環(huán)，接種到裝有100mL新配制NB培養(yǎng)液的三角瓶中，于30℃下、振速180r/min培養(yǎng)72h后，終止發(fā)酵，得到菌株ML-3的種子發(fā)酵液。取發(fā)酵液接種到新配制NB培養(yǎng)液中，接種比例為1%（V/V）。于30℃下、振速180r/min培養(yǎng)72h后，終止發(fā)酵。于4℃下、轉(zhuǎn)速10000r/min離心10min，最后將上清液通過(guò)微孔濾膜進(jìn)行除菌，用于蛋白提取。

1.2.4 菌株ML-3抗菌蛋白的硫酸銨鹽析提取

根據(jù)吳艷[5]的方法提取抗菌蛋白，量取1000mL菌株ML-3發(fā)酵液到量杯中，冷水浴中加入飽和度為80%的硫酸銨，并保持?jǐn)嚢瑁腆w溶解后，放置于4℃冰箱中進(jìn)行沉淀。12h后，于轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10min，倒掉上清液。向沉淀物中加入10mL的Tris-HCL（0.01mol/L，pH8.4）緩沖液充分溶解。溶解后將溶解物裝入透析袋中，在Tris-HCL（0.01mol/L，pH8.4）緩沖液中透析，每過(guò)4h更換1次緩沖液，透析72h。透析完成后，于真空冷凍干燥機(jī)中制成凍干蛋白粉，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.5 ML-3抗菌蛋白抑菌活性檢測(cè)

根據(jù)采俊香、李月梅[6]的菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌率。配制濃度為0.1g/L的ML-3抗菌蛋白液，按照1∶9的比例（V∶V）將蛋白液和液體PDA培養(yǎng)基混合，注意不要產(chǎn)生氣泡，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，制備含藥平板，等待凝固。在活化后的馬鈴薯早疫病原真菌平板上用滅菌打孔器取直徑為5mm的菌餅，接種到凝固后的含藥平板中心位置，將Tris-HCl（0.01mol/L，pH8.4）設(shè)置為對(duì)照物，于30℃下恒溫培養(yǎng)3d，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

抑菌率計(jì)算公式：

抑菌率（%）=D2-D3D1-D3×100%

式中，D1為對(duì)照物處理病原菌菌落直徑（mm），D2為抗菌蛋白處理病原菌菌落直徑（mm），D3為菌餅直徑（mm）。

1.2.6 ML-3抗菌蛋白穩(wěn)定性分析

1.2.6.1 溫度對(duì)ML-3抗菌蛋白抑菌性的影響

取8支10mL的滅菌離心管，分別加入5mL抗菌蛋白液，按照溫度梯度為22℃（室溫）、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃在水浴鍋中處理20min，冷卻至室溫，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，方法同1.2.5，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6.2 酸堿度對(duì)ML-3抗菌蛋白抑菌性的影響

取8支10mL的滅菌離心管，分別加入5mL抗菌蛋白液，用HCl和NaOH（C均為1mol/L）分別調(diào)整pH至4.0，5.0，6.0，7.0（原始），8.0，9.0，10.0，11.0，室溫靜置30min，全部調(diào)回原始pH，以未經(jīng)處理的抗菌蛋白液為對(duì)照，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，方法同1.2.5，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6.3 紫外光照對(duì)ML-3抗菌蛋白抑菌性的影響