蛹蟲草種子液的培養條件篩選

牛曉娟　方正　馮曉英

摘 要：通過對蛹蟲草種子液培養的碳源、氮源、培養溫度、初始pH值、搖床轉速等指標進行考察，篩選利于蛹蟲草種子液菌絲體生長的條件。實驗結果表明：培養蛹蟲草種子液最適碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨，最適初始pH為6.0，最適搖床轉速為150r/min，最適培養溫度為26℃左右。

關鍵詞：蛹蟲草;種子液;培養條件

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又稱北蟲草，與野生冬蟲夏草同屬肉座菌目[1]。在蟲草屬中，唯有冬蟲夏草和蛹蟲草是我國最常見的分布較廣的藥用價值極高的2種蟲草菌[2]。有研究表明，蛹蟲草含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、氨基酸、SOD、無機元素等多種有效成分，與冬蟲夏草的化學成分基本相同，某些氨基酸和蟲草素含量甚至高于冬蟲夏草[3，4]。這使得蛹蟲草可作為冬蟲夏草的良好代替品進行生產和消費，尤其在功能食品和醫藥等方面具有很好的實用價值。

在蛹蟲草子實體培養前需要對其種子液進行活化，而在大規模生產中種子液的需求是十分巨大的，所以種子液的培養條件優化是十分重要的一環。文章旨在通過對碳源、氮源、培養溫度、初始pH值、搖床轉速等指標進行考察，篩選利于蛹蟲草液體菌絲生長的條件，以期為批量制備蛹蟲草種子液提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試蛹蟲草菌株（Cordyceps militaris）為本實驗室保藏菌種。

1.2 培養基配方

1.2.1 固體培養基（PDA）

[JP2]馬鈴薯汁200g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏1.0g/L，蛋白胨2.0g/L，[JP]KH2PO4 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，VBl 0.02g/L，瓊脂20g/L，pH6.7，121℃ 0.1MPa蒸汽滅菌30min，用于菌種活化培養[5]。

1.2.2 種子液體培養基

KH2PO4 3.0g/L，MgSO4 1.5g/L，氮源10g/L，碳源20g/L，設定pH，高壓蒸汽滅菌30min。

1.3 培養基培養方法

1.3.1 斜面菌種擴培

將固體平板培養基常規滅菌，冷卻后，在無菌室內將活化好的供試菌種分別接入固體平板中，在25℃恒溫培養箱中暗室培養7d。

1.3.2 種子液培養

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在設定溫度、pH、轉速、碳源、氮源的條件下暗培養5d。

1.4 種子液培養條件篩選

1.4.1 種子液碳源條件篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在溫度為25℃、pH 6.0、轉速150r/min、氮源為蛋白胨、暗培養5d的條件下考察不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖）的影響。

1.4.2 種子液氮源條件篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在溫度為25℃、pH 6.0、轉速150r/min、碳源為葡萄糖、暗培養5d的條件下考察不同氮源（蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硝酸銨、氯化銨）的影響。

1.4.3 種子液初始pH篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在溫度為25℃、轉速150r/min、碳源為葡萄糖、氮源為蛋白胨、暗培養5d的條件下考察不同初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的影響。

1.4.4 種子液搖床培養轉速的篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在溫度為25℃、pH6.0、碳源為葡萄糖、氮源為蛋白胨、暗培養5d的條件下考察不同搖床轉速（50r/min、100r/min、150r/min、200r/min、250r/min）的影響。

1.4.5 種子液培養溫度的篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在初始pH 6.0、搖床轉速為150r/min、碳源為葡萄糖、氮源為蛋白胨、暗培養5d的條件下考察不同培養溫度（20℃、22℃、24℃、26℃、28℃）的影響。

1.5 菌絲測定方法

按1.3中所述方法培養液體菌種，培養結束以1500r/min離心10min，收集菌絲體，用蒸餾水沖洗2～3次，將菌絲球放至已烘干稱重的培養皿中，在80℃下烘干至恒重。

2 結果與討論

2.1 不同碳源對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

結果如圖1所示，在相同的培養條件下，葡萄糖作為蛹蟲草液體培養的碳源時菌絲體的產量最高，菌絲球密度最大，菌絲體干重為0.41g/100mL，其次為蔗糖。以麥芽糖為碳源時菌絲體產量最差，菌絲體干重為0.15g/100mL。原因可能是葡萄糖為單糖更容易被微生物所利用。

2.2 不同氮源對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

從圖2中可以看出，在5種氮源中，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏都有利于菌絲的生長，菌絲球密度都比較大，菌絲體干重分別達0.44g/100mL、0.37g/100mL和0.41g/100mL;硝酸銨和氯化銨在液體培養中產生的菌絲球少，菌絲體干重只有0.14g/100mL和0.17g/100mL。原因可能是蛋白胨、酵母膏、牛肉膏都屬于有機氮源，除含有蛹蟲草生長所需的蛋白質、多肽和游離氨基酸直接作為微生物的氮素營養被吸收利用外，還含有少量的糖類、脂肪、無機鹽和生長素等其它營養物質，更有利于菌絲體的生長發育;硝酸銨和氯化銨屬于無機氮源，對蛹蟲草菌絲的生長發育來說不是優勢氮源。

2.3 搖床轉速對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

從圖3中可以看出，搖床轉速在150r/min時，有利于菌絲生長，產生的菌絲球個體均勻且數量多，菌絲體干重達0.43mg/100mL;轉速為50r/min時，菌絲體干重達0.23mg/100mL。轉速為250r/min時，菌絲體干重為0.28mg/100mL，原因可能是轉速小，液體的溶氧量小，菌體生長緩慢不利于菌絲球形成;轉速大，溶氧量增大，菌絲生長增多，導致菌絲體扭結在一起，也不利于菌絲體正常生長。

2.4 初始pH對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

通過調節液體初始pH，對蛹蟲草菌種的液體發酵能力進行了考查，結果如圖4所示。可以看出菌絲體干重隨著pH增大而增大，pH值為6.0時，菌絲體干重達4.0g/L;而趨于堿性時，菌體量下降，所以蛹蟲草適合生長在弱酸性培養液中。

2.5 培養溫度對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

通過調節種子液培養溫度，對蛹蟲草菌種的液體發酵能力進行了考查，結果如圖5所示。可以看出菌絲體干重隨著溫度增高而增大，在培養溫度為26℃時，菌絲體干重為0.41g/100mL，但當溫度超過30℃時，菌絲體量則下降，即溫度過低或過高，均會影響菌體的生長。

3 小結

本實驗結果表明，培養蛹蟲草種子液最適碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨，最適搖床轉速為150r/min，最適初始pH為6.0，最適培養溫度為26℃左右。

參考文獻

[1]梁宗琦，劉愛英，劉作易.中國真菌志（蟲草屬）[M].北京：科學出版社，2007：137-152.

[2]李軍，陳廣生，方清茂，李洪水.人工培養蛹蟲草與冬蟲夏草的比較研究[J].成都中醫藥大學學報，2010，33（3）：82-84.

[3]馬冰如，何玲，張甲生，等.蠶蛹蟲草與冬蟲夏草化學成分的比較[J].中國食用菌，1994，13（1）：34-37.

[4]李楠，宋健國，劉金云，張宏.蛹蟲草與冬蟲夏草化學成分比較[J].吉林農業大學學報，1995，17（增刊）：50-53.

[5]鄒湘月，羅巍，吳鄭武，劉東波，謝紅旗.北蟲草液體培養基配方的優化[J].食用菌，2012（4）：10-12，31.

（責任編輯 李媛媛）