微塑料（MPs）與全氟辛烷磺酸鹽（PFOS）復(fù)合暴露對普通小球藻的毒性研究

蘇佳偉 俞博浩 張德勇

【摘 要】為分析MPs與PFOS染物復(fù)合暴露對普通小球藻的毒性效應(yīng)，分別設(shè)計(jì)了兩種物質(zhì)單獨(dú)及復(fù)合染毒實(shí)驗(yàn)，以普通小球藻為受試生物，分析增殖速度及各生理指標(biāo)。單獨(dú)染毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)MPs、PFOS均會抑制藻類的增殖速度，96h-EC50值分別為95.85 mg/L和311.06 mg/L;伴有葉綠素含量、總抗氧化能力、抗氧化酶活力、可溶性蛋白含量的下降;另外蛋白表達(dá)異常、MDA含量上升。復(fù)合染毒時仍出現(xiàn)上述毒性效應(yīng)，但各指標(biāo)的聯(lián)合毒性普遍低于單獨(dú)染毒的效應(yīng)之和，即呈現(xiàn)出一定的拮抗效應(yīng)，但是當(dāng)染毒物質(zhì)的劑量提高后，這種拮抗效應(yīng)有所減弱。

【關(guān)鍵詞】微塑料（MPs）;全氟辛烷磺酸鹽（PFOS）;普通小球藻;復(fù)合暴露;毒性效應(yīng)

微塑料（Microplastics，MPs）指尺寸小于5 mm的塑料碎片、顆粒及纖維，因其體積小而易于進(jìn)入生物體內(nèi)。人類大量使用塑料已有100多年，據(jù)統(tǒng)計(jì)僅我國2016年塑料制品總產(chǎn)量就達(dá)到了7717萬噸。塑料制品的濫用和排放已致大量MPs進(jìn)入了環(huán)境介質(zhì)，成了重要的環(huán)境污染物。藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者，處于食物鏈底端，評價MPs對藻類的影響可以為全面認(rèn)識其生態(tài)危害提供很好的切入點(diǎn)。當(dāng)前關(guān)于MPs的毒性效應(yīng)及其機(jī)制的研究尚不夠系統(tǒng)，針對藻類的研究尤其不足。MPs對藻類的毒性可為可抑制細(xì)胞生長、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、降低葉綠素含量和光合效率、引起細(xì)胞氧化損傷等，且毒性大小與微塑料本身的種類、大小、濃度等有關(guān)[1-3]。

Besseling等研究了納米的聚苯乙烯（PS）對斜生柵藻生長和光合作用的影響，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨納米級PS 濃度增加藻細(xì)胞生長抑制率升高，相反，葉綠素a 含量降低[4]。Zhang 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明96 h暴露實(shí)驗(yàn)后，微米級聚氯乙烯對中肋骨條藻生長抑制率可達(dá)39.7%;在高濃度（50 mg/L）暴露實(shí)驗(yàn)中，葉綠素含量和光合效率也明顯下降;而毫米級微塑料聚氯乙烯（MP-PVC）對微藻的生長沒有明顯影響。觀察發(fā)現(xiàn)PVC破壞了藻細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性。PVC暴露實(shí)驗(yàn)初期，藻細(xì)胞生長明顯受到抑制、葉綠素含量和光合效率明顯下降;暴露實(shí)驗(yàn)后期，不良影響效應(yīng)減小，但仍低于空白對照水平在另一研究中，MP-PS明顯抑制特氏杜氏藻生長，并且PS 粒徑越小抑制作用越明顯，但對光合作用卻沒有影響[3]。另外，Bhattacharya等發(fā)現(xiàn)MP-PS不僅能降低小球藻和柵藻光合作用效率，而且還增加了藻細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量。微塑料影響藻細(xì)胞生長的同時，藻細(xì)胞也會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)以減小、修復(fù)微塑料對其造成的損傷，但當(dāng)損傷程度超出藻細(xì)胞自我修復(fù)能力范圍后會導(dǎo)致藻細(xì)胞生長異?；蛩劳?。Mao等研究聚苯乙烯微塑料（MP-PS）對蛋白核小球藻的毒性，并首次報(bào)道了微塑料具有抑制和刺激藻細(xì)胞生長的雙重作用[1]。同時，MPs對水中的溞類、貝類等低等動物的毒性效應(yīng)也被證實(shí)，因此可以說MPs對水生生態(tài)系統(tǒng)的威脅是全方位的[5-9]。

但當(dāng)前研究絕大多數(shù)采用了MPs單獨(dú)染毒方式，其結(jié)論遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能反映實(shí)際環(huán)境中MPs因和其他污染物共同存在可能導(dǎo)致的復(fù)合效應(yīng)。為分析MPs與其他污染物聯(lián)合暴露對淡水藻類具有何種效應(yīng)并初步揭示其產(chǎn)生機(jī)制，本研究擬評價不同劑量的MPs與PFOS聯(lián)合染毒后，對普通小球藻的增殖、光合作用、抗氧化能力等方面的毒性效應(yīng)及其與單獨(dú)染毒的差異。其中所選擇的PFOS污染物是水體環(huán)境中普遍存在的具有代表性的污染物，它具有親脂性、持久性、生物累積性和生物毒性等特點(diǎn)，且被證實(shí)對多種生物具有毒性效應(yīng)[10-13]。本研究的結(jié)果有助于更全面地認(rèn)知MPs與水體中其他污染物聯(lián)合暴露對藻類的復(fù)雜毒性效應(yīng)，為相關(guān)污染物的治理提供科學(xué)依據(jù)，并為進(jìn)一步研究其對高等生物的毒性效應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻類培養(yǎng)及染毒方案

普通小球藻（Chlorella vulgaris）及淡水綠藻專用培養(yǎng)基購自中科院水生所。微塑料材料為聚乙烯（PE）原料粉末，粒徑為微米級。藻類培養(yǎng)條件為25℃、12h/12h光暗循環(huán)。單獨(dú)染毒、聯(lián)合染毒方案參見結(jié)果部分的表格。藻類染毒后繼續(xù)培養(yǎng)96h后分析各指標(biāo)。

1.2 藻類生物量的光密度分析法的建立

首先對藻液進(jìn)行全波長掃描，找出特征吸收峰。然后分別利用吸光度法與顯微鏡計(jì)數(shù)法建立藻濃度與吸光度值之間的回歸方程。

1.3 藻類的生長抑制效應(yīng)分析及96h-EC50值計(jì)算

基于A690值繪制生長曲線，建立抑制率P和濃度的自然對數(shù)LnC的線性回歸關(guān)系，求解抑制率為50%的濃度值即EC50值。抑制率P（%）=（對照組A690-處理組A690）/對照組A690

1.4 抗氧化酶活性測定

1.4.1 SOD活性測定

收集藻細(xì)胞，研磨、離心，取上清為SOD粗提液。采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活力，再按照2.35mL Tris-HCl緩沖液、1.8mL蒸餾水、0.15mL鄰苯三酚溶液、200μL樣液的反應(yīng)體系測定ΔA325。U=[（A325-ΔA325）/ΔA325×100%]/50%×Vs×D/V總。

1.4.2 POD活性測定

藻細(xì)胞破壁后，上清充分轉(zhuǎn)入25mL容量瓶定容。取比色皿加入反應(yīng)混合液3ml和酶液1mL。立即開啟秒表記錄A470，每隔1min讀數(shù)1次，共5min。U=（A470×0. 01×W ×t）×樣品稀釋倍數(shù)。

1.4.3 CAT活性測定

藻細(xì)胞破壁后，加入3mL0.05mol/L pH7.8 PBS，再加入200μL 30%H2O2迅速搖勻，1分鐘后開始，每1 min記錄1次A240，連續(xù)記錄5min。U=ΔA240×Vt/W/Vs/0.01/t。

1.5葉綠素含量測定

藻液用高速離心法提取，加1.5mL乙醇和少許石英砂研磨，轉(zhuǎn)入離心管定容到10mL，于4℃黑暗提取12h;4000rpm離心10min;上清于比色管中用90%乙醇定容10mL。于比色皿中，測吸光值。葉綠素a濃度（mg/L）=（11.64A633+2.16A645+0.10A630）V1/1000V2。式中V1為提取液定容體積（mL）;V2為濾液體積（L）。

1.6可溶性蛋白含量測定

取藻類破壁離心后的上清于1cm光程石英比色皿中測定A280和A260，按公式計(jì)算可溶性蛋白含量。

1.7 藻類MDA活性測定

藻液離心后加10%TCA研磨，勻漿液12000rpm離心10min。取2mL上清于試管，加入0.6%硫代巴比妥酸2mL，沸水浴10min。4500rpm離心10min，取上清測吸光度。MDA濃度=6.45（A532-A600）-0.56×A450。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用單因素方差分析（One Way ANOVA）分析處理組與對照組之間的差異顯著性，p<0.05為顯著。

2 結(jié)果

2.1藻類生物量的光度分析法的建立

經(jīng)連續(xù)波長掃描，普通小球藻在690nm處有吸收峰;然后基于藻密度與A690建立了線性回歸方程：y=0.025x+0.0403;R?=0.9613。二者具有較理想的線性關(guān)系，便于快速測定藻類生物量。

2.2單獨(dú)及聯(lián)合染毒對普通小球藻的增殖速度的影響

如圖1所示，MPs及PFOS單獨(dú)染毒對小球藻均有抑制效應(yīng)，96h-EC50為95.85mg/L。聯(lián)合染毒則均呈現(xiàn)為拮抗作用，即MPs+PFOS聯(lián)合染毒引起的抑制率小于單獨(dú)染毒的抑制率之和（0.405<0.517;0.334<0.508）。

2.3單獨(dú)及聯(lián)合染毒對普通小球藻抗氧化酶活性的影響

如表1所示，單獨(dú)染毒下三種物質(zhì)對藻類的抗氧化酶活性均有抑制效應(yīng)。聯(lián)合染毒時，MPs+PFOS的抑制值（SOD 9.980、5.703;POD 0.510、0.469;CAT 44、24）小于單獨(dú)染毒相加之和。因此MPs與PFOS聯(lián)合染毒時均呈現(xiàn)為拮抗作用。

2.4 MPs單獨(dú)及聯(lián)合染毒對普通小球藻葉綠素含量的影響

如表2所示，染毒物單獨(dú)染毒均可導(dǎo)致小球藻葉綠素含量下降。聯(lián)合染毒的表現(xiàn)則以輕度的協(xié)同效應(yīng)為主。MPs+PFOS的聯(lián)合效應(yīng)則因劑量不同而出現(xiàn)了一些波動（0.458<0.493;0.409>0.365）。

2.5 單獨(dú)及聯(lián)合染毒對普通小球藻可溶性蛋白含量的影響

如表2所示，MPs和PFOS的染毒均導(dǎo)致小球藻的可溶性蛋白含量下降。而在聯(lián)合染毒實(shí)驗(yàn)中，MPs+PFOS呈現(xiàn)低劑量時表現(xiàn)為協(xié)同作用（0.640>0.290），高劑量表現(xiàn)為輕度拮抗（0.715<0.770），這種情況比較復(fù)雜，顯示不同污染物之間的作用可能會受各種因素影響，甚至?xí)騽┝康牟煌霈F(xiàn)相反的結(jié)果。

2.6 MPs單獨(dú)及聯(lián)合染毒對普通小球藻MDA含量的影響

如表2所示，各染毒組MDA 含量均高于空白對照組，且隨著染毒濃度的增加而升高，而在低濃度PFOS 下其MDA 含量（0.300）與空白對照組（0.295）相差不大，可見低濃度的PFOS 對藻類MDA含量影響不大。同樣的比較MPs 陰性染毒組與PFOS 陰性染毒組，如M2P0 的MDA 含量為1.179μmol/L，而M0P2 的MDA 含量為0.656μmol/L 可以發(fā)現(xiàn)MPs 對藻類MDA 含量的毒性效應(yīng)更大更顯著。聯(lián)合染毒組的MDA 含量升高程度普遍小于所對應(yīng)的單獨(dú)染毒組之和。故可以認(rèn)為MPs與PFOS 聯(lián)合染毒表現(xiàn)了一定的拮抗效應(yīng)。

3討論

當(dāng)前MPs已成為引人關(guān)注的重要污染物。水中的MPs會被生物誤以為浮游生物而主動對其進(jìn)行捕食，從而進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈（網(wǎng)）。研究發(fā)現(xiàn)許多水生動物的胃、消化管、肌肉等組織和器官中均含有微塑料存在。近來甚至在人體內(nèi)也普遍檢測到了微塑料的存在，且種類多達(dá)數(shù)十種。藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)者，MPs對藻類的影響關(guān)系到整個水生生態(tài)系統(tǒng)的維系。在本研究中，MPs被證實(shí)能抑制普通小球藻的增殖，并引起葉綠素含量、抗氧化能力等的下降等，這一結(jié)論與與以往在其他藻類上的研究報(bào)道基本一致（雖然以往某些研究稱觀察到同時促進(jìn)和抑制藻類生長的所謂“雙重效應(yīng)”，但屬于個例，在本研究所采用的普通小球藻上未觀察到此情況）。同時，與以往研究不同，本研究更側(cè)重于考察MPs與其他污染物聯(lián)合暴露時呈現(xiàn)的毒性效應(yīng)。除了葉綠素指標(biāo)有點(diǎn)例外，在所研究的絕大多數(shù)指標(biāo)中，我們均證實(shí)了MPs、PFOS聯(lián)合暴露時，會呈現(xiàn)一定的拮抗效應(yīng)，即聯(lián)合毒性低于兩種物質(zhì)單獨(dú)暴露引起的毒性之和。這一現(xiàn)象以往罕有探討，初步分析其原因可能是MPs具有較強(qiáng)的吸附性和漂浮性，導(dǎo)致其他污染物能被吸附在其顆粒上而無法發(fā)揮對藻類的毒性。另外，結(jié)果也顯示當(dāng)染毒劑量雙雙升高時，拮抗效應(yīng)往往有所減弱。

本研究在評估藻類的狀態(tài)采用了葉綠素、抗氧化狀態(tài)、蛋白表達(dá)、可溶性蛋白含量幾個重要指標(biāo)。葉綠素是光合作用的執(zhí)行者，測定葉綠素含量可以了解植物物質(zhì)轉(zhuǎn)化的程度和速度，其含量高低直接反映藻類的生長繁殖能力。以MPs+PFOS聯(lián)合染毒為例，空白對照組葉綠素含量為0.572mg/L，而各染毒組依次為0.367、0.284、0.163、0.131、0.138和0.114mg/L，最低組僅為空白組的19.9%，降低非常明顯。雖然聯(lián)合染毒有一定的拮抗效應(yīng)，但對于緩解這種毒性效應(yīng)實(shí)際意義不大。藻類的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系，抗氧化酶的活力有助于大致藻類的健康狀況。以MPs+PFOS聯(lián)合染毒為例，為了充分評估普通小球藻的抗氧化狀態(tài)，分別測定了3種抗氧化酶的活力。其中SOD是負(fù)責(zé)清除氧自由基的酶，POD藻類體內(nèi)負(fù)責(zé)分解過氧化物的酶，CAT是能夠催化過氧化氫分解為水和分子氧，這三者均是藻類抗氧化損傷、清除代謝廢物的關(guān)鍵物質(zhì)，對藻類的生長代謝非常重要[14，15]。以MPs與PFOS對小球藻的SOD活性影響為例，空白組SOD活性為15.946U/g，MPs染毒組的數(shù)值分別為7.248U/g、5.315U/g，聯(lián)合染毒組中活性最高的為3.383U/g，最低的為0.966U/g，分別為對照組的45.45%、33.33%、21.21%和6.05%?？扇苄缘鞍踪|(zhì)有助于藻類對抗環(huán)境脅迫，還能增加細(xì)胞滲透濃度和功能蛋白的數(shù)量，有助于維持細(xì)胞正常代謝，因此也是反映抗逆狀態(tài)的指標(biāo)。在本研究中，低劑量的MPs對可溶性蛋白產(chǎn)生的毒性效應(yīng)微小，但POFS結(jié)合后則會產(chǎn)生協(xié)同作用，大大增強(qiáng)TCS對可溶性蛋白的毒性。MDA是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量反映藻類遭受逆境傷害的程度。MPs在本研究被證實(shí)對藻類的細(xì)胞膜能夠造成嚴(yán)重危害，并且在MPs與PFOS聯(lián)合染毒中對MDA含量存在著協(xié)同作用。這進(jìn)一步增強(qiáng)了染毒物對藻類細(xì)胞膜的破壞。

本研究初步證實(shí)了MPs對藻類有顯著的毒性效應(yīng)但同時也能適度減輕水體中存在的其他污染物的毒性。當(dāng)多種毒物同時作用于藻類時，呈現(xiàn)的效應(yīng)非常復(fù)雜。MPs的毒性機(jī)制涉及破壞光合作用、損害抗氧化能力、影響某些蛋白的表達(dá)等，但尚有許多問題有待進(jìn)一步研究，例如在具體哪些蛋白發(fā)生了表達(dá)異常、微塑料有無引起藻類的DNA損傷等。

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作者簡介：

蘇佳偉，2000年11月出生，男，漢族，浙江嘉興人，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ?，單位：浙江樹人大學(xué);

俞博浩，2000年6月出生，男，漢族，浙江舟山人，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ?，單位：浙江樹人大學(xué);

通訊作者：

張德勇，1978年4月出生，男，漢族，山東聊城人，博士生，教授，研究方向?yàn)槎纠砩鷳B(tài)學(xué)，工作單位：浙江樹人大學(xué)。

基金項(xiàng)目：

本研究受浙江樹人大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目（2021JS3012）資助。

（作者單位：浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院）