超聲波對樟芝孢子萌發與細胞形態的影響

孫玲　劉利平　王杰　李巧　何榮海　馬海樂

摘要 以樟芝菌節孢子為研究對象，通過單因素試驗，分析超聲介入時間點、超聲功率密度、超聲頻率和超聲時長對樟芝菌節孢子發芽率的影響，優化了超聲波對樟芝菌節孢子萌發的最佳處理條件：在樟芝菌節孢子接種到培養基中培養9 h后，超聲波頻率為22 kHz、功率密度為60 W/L處理15 min。采用掃描電鏡觀察了超聲波對節孢子細胞壁的影響，發現超聲波處理引起樟芝菌節孢子細胞壁表面形成很多針狀物，在一定程度上破壞了細胞壁的結構，隨著恢復培養時間的推移，逐漸恢復為表面光滑的細胞壁，這些結果表明可能是由于超聲波處理在一定程度上破壞了樟芝節孢子細胞壁的結構，從而促進了樟芝菌節孢子的萌發。

關鍵詞 樟芝菌;節孢子;超聲波處理;發芽率;細胞形態

中圖分類號 TS201.3文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）11-0178-04

Abstract Taking Antrodia camphorara arthrospores as the research object， the effects of ultrasonic intervention time point， ultrasonic power density， ultrasonic frequency and ultrasonic time on the germination rate of Antrodia camphorara arthrospores were analyzed by a single factor test. The optimal treatment conditions for germination of Antrodia camphorara arthrospores by ultrasound were optimized： after arthrospores of Antrodia camphorara cultivated for 9 hours in medium culture， ultrasonic treatment were performed at power density of 60 w/L and frequency of 22 kHz for 15 min. Using scanning electron microscopy （SEM） to observe the effects of the ultrasonic on the cell walls of arthrospores， it was found that the ultrasonic treatment causes the cell walls of arthrospores formed many needles， which destroyed the structure of the cell wall to a certain extent. With the restoration of culture time， it gradually returned to a smooth cell wall. These results suggested that the ultrasonic treatment promoted the germination of arthrospores likely due to the destroyed cell call caused by ultrasonic treatment.

Key words Antrodia camphorate;Arthrospores;Ultrasonic treatment;Germination rate;Cellular morphology

樟芝（Antrodia camphorata），又稱牛樟芝，含有多糖、三萜、倍半萜等多種活性物質，具有抗氧化、消炎、提高免疫力、保肝護肝等功能[1-4]。樟芝屬于真菌界、擔子菌門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬，專一寄生在臺灣特有的常綠闊葉喬木牛樟樹腐朽樹木上，是一種珍稀的藥用真菌。由于野生樟芝的生長非常緩慢，而且樟芝專一寄生的牛樟樹資源稀缺，導致野生樟芝子實體的市場價格非常昂貴。液體深層發酵是解決野生樟芝資源緊缺的重要方法，液體深層發酵可在短時間內收集到大量的菌絲體和有效成分[5-6]。樟芝菌絲固體培養和液體培養過程中產生無性孢子——節孢子[7-8]，該孢子可以作為接種物在液體培養時萌發成菌絲，進而互相纏繞形成菌絲球。

優化培養基、施加外界條件可有效提高樟芝菌絲體的發酵產量。其中，超聲波已被證實可用于促進多種微生物的生長代謝。超聲波是指頻率高于20 kHz的聲波，具有穿透能力強、方向性、在水中的傳播距離遠等特點。利用超聲波輻射過程中產生的熱效應、空化效應和機械剪切效應，有利于提高物質分子的運動速率和頻率，從而影響了微生物的生長發育[9-11]、代謝過程[12]、種子萌發[13-14]、品質[15-16]等。為了進一步分析超聲波對樟芝菌發酵過程的影響，筆者選擇了樟芝菌發酵過程中產生的節孢子為研究對象，分析超聲波對樟芝節孢子萌發率及其產量的影響，為超聲波輔助樟芝發酵的生產應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。

該研究所用的樟芝菌株是ATCC 200183，從美國菌種保藏中心購買。

1.1.2 試劑。

葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、NaCl和瓊脂粉均購自國藥化學試劑公司;酵母粉購自北京蘭博利德公司商貿公司代理的OXOID品牌。

1.1.3 儀器與設備。

電子天平，塞利多斯公司;滅菌鍋，天水華圓醫療器械有限公司;鼓風干燥箱，上海一恒有限公司;超凈工作臺，蘇凈臺有限公司;生化培養箱，上海一恒公司;搖床，江蘇太倉強樂公司;低溫離心機，湖南湘儀儀器開發有限公司;磁力加熱攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠;pH酸度計，上海雷磁有限公司;HITACHIS-570掃描電子顯微鏡，美國Agilent公司;倒置熒光顯微鏡，卡爾·蔡司公司;定頻超聲波設備，自行研發（圖1）。

1.2 方法

1.2.1 樟芝菌株的接種與培養。

1.2.1.1

樟芝菌的試管斜面保存。切下一塊5 mm×5 mm的含有樟芝菌的固體培養基，置于PDA斜面上，28 ℃生化培養箱培養，待長滿斜面培養基后，加入30%的無菌甘油，封好試管，放入4 ℃的冰箱中，用于菌種保存。

1.2.1.2

樟芝菌的固體培養。切下一塊5 mm×5 mm的含有樟芝菌的固體培養基，置于制作好的PDA培養皿中間，蓋上培養皿，用封口封好。放入28 ℃的生化培養箱，倒置培養。

1.2.1.3

樟芝菌的液體培養。切下5塊5 mm×5 mm的含有樟芝菌的固體培養基，置于裝有150 mL PDA的培養基中，8層紗布封口，放入搖床中，28 ℃，150 r/min培養。

1.2.2 樟芝菌節孢子的收集與接種[17-18]。

將含有樟芝菌的培養基接種到PDA培養皿上，在28 ℃的生化培養箱中培養21 d，接著用大約10 mL的無菌生理鹽水（0.85%）洗下孢子，經3層無菌擦鏡紙過濾到50 mL離心管后，4 ℃，7 000 r/min離心，棄掉上清，用無菌生理鹽水（0.85%）懸浮清洗孢子2次，離心后，收集沉淀，再用4～5 mL生理鹽水懸浮，用移液槍吸打混勻后取微量于血球計數板計數。剩余孢子用于培養。

根據血球計數板計數孢子濃度，按接種后孢子濃度為1×106 spores/mL的接種量分別接到3個裝有50 mL發酵基礎培養液（葡萄糖20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，pH=4.5）的搖瓶中，作為3個生物重復。

孢子接種量（spores/mL）=孢子數（spores）/接種后的培養基體積（mL）。

1.2.3 超聲處理樟芝菌的節孢子。

在定頻超聲波槽中加入5 L水，將定頻超聲的總超聲時間分別調為每個周期超聲時間10 s，間隔時間為15 s，分別設定超聲介入時間點、超聲功率密度、超聲時長和不同的單因素做超聲條件的優化：

①當單因素為超聲介入時間點時，設置剛接入節孢子0、3、6、9 h后用頻率為22 kHz、功率為60 W/L的超聲波處理15 min;

②當單因素為超聲功率密度時，分別設置超聲功率密度為30、60、90、120和150 W/L，在孢子接入培養液中9 h后，用頻率為22 kHz的超聲波處理15 min;

③當單因素為超聲時長時，分別設置超聲時間為15、30、45、60和75 min，在孢子接入培養液中9 h后，用頻率為22 kHz且功率密度為60 W/L的超聲波處理;

④當單因素為超聲頻率時，分別設置超聲頻率為22、28、33、40、68 kHz，在孢子接入培養液中9 h后，用功率密度為60 W/L的超聲波處理15 min。

1.2.4 樟芝節孢子萌發率的統計。

接種孢子正常培養8、16、24、32、40、48 h后，取樣，用普通光學顯微鏡觀察孢子生長情況，以孢子長度超過原來的2倍視為孢子萌發[25]，統計各個時間點的孢子萌發率，繪制孢子萌發變化趨勢圖;對于超聲波單因素試驗，在接種孢子正常培養19 h時統計孢子萌發率。吸取每一瓶中的樟芝節孢子培養液置于血球計數板上，統計50個節孢子的萌發率，重復取3次，計算每一個生物重復的節孢子的萌發率均值，采用同樣的方法計算3個生物重復的節孢子萌發率，采用標準誤差（SE）用于生物學統計分析超聲處理對節孢子萌發率提高率的影響。

1.2.5 掃描電鏡觀察樟芝菌節孢子。

從樟芝菌平板上收集較多的節孢子接種到發酵基礎培養液中，利用頻率為22 kHz、功率密度為60 W/L的超聲波處理15 min后，收集樟芝孢子先用PBS緩沖液清洗3次，2.5%戊二醛溶液在4 ℃冰箱中固定4 h，再用PBS緩沖液清洗3次，先后采用含有30%、50%、70%、85%、90%體積濃度的無水乙醇梯度脫水各1次，每次15 min;再用100%乙醇脫水2次，每次15 min，乙酸異戊酯清洗2次，每次浸泡15 min，5 000 r/min離心5 min，最后冷凍干燥。將冷凍干燥后的樣品粘附于干凈的鋁箔片上，置于樣品艙中進行噴金。樣品取出后，置于HITACHIS-570掃描電子顯微鏡觀察室中進行觀察。

2 結果與分析

2.1 樟芝孢子發芽率的變化趨勢

從試管中保藏的樟芝菌斜面上切取5 mm×5 mm轉移新鮮配制的PDA培養基上，28 ℃培養箱中培養3 d后慢慢生長出黃色的菌絲，7 d后菌絲體逐漸變厚，顏色變深，當培養30 d后，樟芝菌絲基本鋪滿培養皿（圖2a）。待菌絲生長30 d后，通過刮取固體培養基上的菌絲，過濾收集樟芝節孢子如圖2b所示。通過將分離出的樟芝菌節孢子接種到孢子萌發培養基中，統計分析了孢子萌發率，如圖3所示，樟芝菌節孢子在接種后的第16小時，節孢子開始萌發，其萌發率為14.1%;24 h時，節孢子萌發率為68.7%;32 h時，節孢子萌發率為75.5%;48 h時，節孢子萌發率為100%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲波處理介入時間點對樟芝菌節孢子萌發率的影響。

為了分析在接種后的不同時間介入超聲處理對樟芝菌節孢子發芽率增長率的影響，用頻率為22 kHz、功率密度為60 W/L的超聲波對節孢子處理15 min，如圖4所示，與未處理的對照相比，當節孢子接種到培養基后（0 h）立即超聲波處理，節孢子萌發率提高了14.8%;當節孢子接種后培養3 h再超聲波處理，節孢子萌發率沒有提高;當節孢子接種后培養6 h再超聲波處理，節孢子萌發率提高了22.0%;當樟芝菌節孢子接種后培養9 h再超聲波處理，節孢子萌發率提高了59.7%，可見在當樟芝菌節孢子接種到孢子萌發培養基后培養9 h為最佳的超聲波介入處理時間點。

2.2.2 超聲功率密度對樟芝菌節孢子萌發率的影響。

為了分析超聲功率密度對樟芝菌節孢子發芽率的影響，用頻率為22 kHz的超聲波對剛接種到孢子萌發培養基后的樟芝菌節孢子（0 h）超聲處理15 min，如圖5所示，與未處理的對照相比，超聲功率密度為60 W/L時，超聲處理后的樟芝菌節孢子發芽率提高了39.3%;當超聲功率密度為120 W/L時，發芽率提高了32.5%;當超聲功率密度為150 W/L時，發芽率提高了26.2%;當超聲功率密度為30和90 W/L時，發芽率提高不明顯。因此，60 W/L為最佳超聲功率密度。

2.2.3 超聲時長對樟芝菌節孢子萌發率的影響。

為了分析超聲時長對樟芝菌節孢子發芽率的影響，用頻率為22 kHz、功率密度為60 W/L的超聲波對剛接種到孢子萌發培養基后的樟芝菌節孢子（0 h）超聲處理不同時間，如圖6所示，與未處理的對照相比，超聲時長為15 min時，樟芝菌節孢子發芽率提高了36.4%;超聲時長為75 min時，節孢子發芽率提高了10.8%;當超聲處理時間為30、45和60 min時，節孢子發芽率提高不明顯甚至降低了。因此，15 min為最佳的超聲處理時間。

2.2.4 超聲頻率對樟芝菌節孢子萌發率的影響。

為了分析超聲頻率對樟芝菌節孢子發芽率的影響，用不同頻率但功率密度為60 W/L的超聲波對剛接種到孢子萌發培養基后的樟芝菌節孢子（0 h）超聲處理15 min，如圖7所示，與未處理的對照相比，超聲頻率為22 kHz時，超聲處理后的樟芝菌節孢子發芽率提高了23.3%;超聲頻率為28和68 kHz時，超聲處理對節孢子發芽率影響較小;但當超聲頻率為33和40 kHz時，超聲處理對樟芝菌節孢子發芽率有降低作用。因此，22 kHz為最佳的超聲處理頻率。

2.3 掃描電鏡分析超聲處理對樟芝菌節孢子細胞形態的影響

為了進一步分析超聲波對樟芝菌節孢子發芽的影響，利用掃描電鏡觀察分析優化后的超聲波處理對樟芝菌節孢子細胞形態的影響。如圖8所示，未施加超聲波處理的對照組的節孢子表面光滑，細胞壁紋理清晰，當超聲波處理后，節孢子細胞壁表面不光滑，有很多針狀物，在節孢子的兩端周邊有裂痕;當超聲處理后恢復培養4 h（圖9），節孢子細胞壁表面的針狀物消失，表面只殘留一些碎片狀的殘留物;當超聲波處理后恢復培養12 h（圖9），處理組的節孢子細胞壁與對照組細胞壁相似，細胞壁表面光滑，但處理組中部分節孢子長度伸長、細胞壁明顯破裂，節孢子開始萌發。由此可見，超聲波處理引起樟芝菌節孢子細胞壁表面形成很多針狀物，在一定程度上破壞了細胞壁的結構，隨著恢復培養時間的推移，逐漸恢復為表面光滑的細胞壁，推測正是由于超聲波對細胞壁結構的破壞促進了樟芝菌節孢子的萌發。

3 結論

該研究通過單因素試驗優化了超聲波對樟芝菌節孢子萌發的最佳處理條件：在樟芝菌節孢子接種到培養基中培養9 h后，超聲波頻率為22 kHz、功率密度為60 W/L處理15 min。通過掃描電鏡分析發現，超聲波處理引起樟芝菌節孢子細胞壁表面形成很多針狀物，隨著恢復培養時間的推移，逐漸恢復為表面光滑的細胞壁;超聲波處理節孢子對發酵前期和高峰期的菌絲球產量影響較小，但超聲波處理明顯有利于保持樟芝菌產量的降低，有利于保持更長時間的發酵生長活力，可能有利于更多代謝物的產生。

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