多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用與展望

董蕾　黃曉波　劉靜璇

摘要 多重PCR技術(shù)建立在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，作為一種高效、快速、高靈敏性及特異性的方法，其被應(yīng)用在食品檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域。從食品安全檢測(cè)角度，簡(jiǎn)要論述多重PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和弓形菌等食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用，并根據(jù)長(zhǎng)期工作總結(jié)多重PCR技術(shù)操作的重難點(diǎn)和前景展望，以期為多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的工作提供幫助。

關(guān)鍵詞 多重PCR;食品致病菌;檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào) TS207.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2020）11-0015-04

AbstractMultiplex PCR which is based on conventional PCR is an efficient， fast， sensitive and specific method for food detection. In this paper， the application of multiplex PCR in detection of foodborne pathogenic bacteria such as Escherichia coli， Staphlococcus aureus and Arcobacter， etc. was discussed to provide support for the work of multiplex PCR technology in food detection.

Key words Multiplex PCR;Food pathogenic bateria;Detection

自1988年Chamberlain等[1]首次提出多重PCR技術(shù)（multiplex polymerase chain reaction，MPCR），并利用該技術(shù)進(jìn)行杜氏營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne musculardystrophy）基因外顯子缺失的檢測(cè)以來(lái)，多重PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)（包括遺傳病診斷、病原體檢測(cè)等）、食品科學(xué)（食品原料溯源、食品病原微生物檢測(cè)等）等科學(xué)領(lǐng)域均有極大貢獻(xiàn)，成為檢測(cè)的一項(xiàng)重要技術(shù)工具。筆者從食品安全檢測(cè)角度，簡(jiǎn)要論述多重PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和弓形菌等食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用，并根據(jù)長(zhǎng)期工作總結(jié)多重PCR技術(shù)操作的重難點(diǎn)和前景展望，以期為多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的工作提供幫助。

1 多重PCR技術(shù)簡(jiǎn)介

多重PCR技術(shù)又稱(chēng)多重引物PCR或復(fù)合PCR技術(shù)，是一種建立在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，并進(jìn)行改進(jìn)的新型PCR技術(shù)。不同于常規(guī)PCR的單一引物擴(kuò)增，在多重PCR體系中同時(shí)加入多對(duì)引物進(jìn)行多目標(biāo)DNA片段擴(kuò)增[2]，由于目標(biāo)片段大小不同，經(jīng)由多重PCR擴(kuò)增后，凝膠成像即可直接進(jìn)行分析[3]。該方法相比常規(guī)PCR方法，因其在同一體系中同時(shí)進(jìn)行多目標(biāo)DNA片段的擴(kuò)增，從而達(dá)到節(jié)約模板DNA、節(jié)省時(shí)間和成本的優(yōu)勢(shì)。

多重PCR技術(shù)建立在常規(guī)PCR技術(shù)之上，利用模板DNA、多對(duì)引物、4種脫氧核糖核苷酸，依賴(lài)于DNA聚合酶完成酶促合成反應(yīng)。多重PCR技術(shù)具有高效性：在同一反應(yīng)體系、反應(yīng)時(shí)間內(nèi)可以同時(shí)檢測(cè)多種病原菌或目標(biāo)基因;系統(tǒng)性：對(duì)于同一食品或癥狀相同的病原菌可以進(jìn)行同時(shí)檢測(cè);經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性：由于在同一體系內(nèi)同時(shí)反應(yīng)，可大大節(jié)約檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)試劑[4]。

2 多重PCR技術(shù)在食品致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

多重PCR技術(shù)在同一體系中加入不同目標(biāo)片段的引物，即可完成在一次反應(yīng)中多個(gè)目標(biāo)片段的同時(shí)擴(kuò)增，多重PCR技術(shù)大大提升了檢驗(yàn)過(guò)程的時(shí)長(zhǎng)、降低了試劑耗材的損耗，使檢驗(yàn)過(guò)程快速簡(jiǎn)便，被廣泛應(yīng)用于食品檢驗(yàn)的各個(gè)領(lǐng)域。

2.1 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，SA）在自然界分布廣泛，是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，能夠引起人和動(dòng)物的嚴(yán)重感染發(fā)病，是一種重要的人類(lèi)病原菌[5-6]。該菌所產(chǎn)生的腸毒素（SE）引起的食物中毒是世界性的衛(wèi)生難題，在美國(guó)、加拿大等國(guó)家，由于金黃色葡萄球菌引起的食物中毒現(xiàn)象超過(guò)30%，中國(guó)也時(shí)有發(fā)生。近年來(lái)利用PCR技術(shù)診斷檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素，使檢測(cè)快速準(zhǔn)確。

楊玉軍等[7]針對(duì)金黃色葡萄球菌最常引起食物中毒的4種類(lèi)別（A、B、C、D型）SE基因保守序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物（表1），對(duì)SE片段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得最優(yōu)反應(yīng)體系，總體積為25 μL體系中，各引物濃度為0.2 μmol/L;徐曉可等[8]以耐熱核酸酶基因nuc、纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因clfA和SmaI限制性酶切片段特異序列為目標(biāo)片段，設(shè)計(jì)引物3對(duì)（表1），驗(yàn)證靈敏度在模板水平上可達(dá)1.197 3 ng;Costa等[9]針對(duì)mecA和nuc目標(biāo)片段，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，效果優(yōu)異（表1）。

2.2 沙門(mén)氏菌的檢測(cè)

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是一類(lèi)革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科，除感染人以外，也會(huì)感染哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等，當(dāng)人接觸含這類(lèi)菌的食物時(shí)均會(huì)引起食物中毒，出現(xiàn)傷寒、腸胃炎、腸毒癥、敗血癥等腸道疾病。每年全球由于沙門(mén)氏菌引發(fā)的食源性疾病均居于食源性疾病病因的前列[10-13]。

邵碧英等[14]根據(jù)沙門(mén)氏屬特異基因hut基因、hilA基因、invA基因和hns基因設(shè)計(jì)特異性引物，實(shí)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的三重PCR;唐雨德等[15]針對(duì)S1、S2、invA基因設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，對(duì)16株沙門(mén)氏菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，靈敏度平均為100 CFU，人工污染樣品最低檢出限為10 CFU，大大縮短檢驗(yàn)時(shí)間（表2）。

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