7月齡及16月齡APP/PS1/tau三轉基因小鼠腦內突觸相關蛋白的變化及山茱萸環烯醚萜苷的影響

楊翠翠 包訓杰 張 麗 李雅莉 李 林 張 蘭

(首都醫科大學宣武醫院藥學部 北京市神經藥物工程技術研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，2015年全球AD患者有4 600萬，預計全球每年AD發病例數為770萬，或每3 s則產生一名患者[1-2]。20世紀90年代以來，已有近200種治療AD的藥物進入人體試驗階段，美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)僅批準6個AD治療藥物，但這些藥只能暫時緩解癥狀[3]。中國人口快速老齡化，AD患病基數大，就診率增高。開發新的有效治療AD的藥物，改善患者生活質量，減少社會及家庭的經濟負擔刻不容緩[4]。

AD又被認為是突觸相關的一類疾病，因此又稱為突觸失效，最終導致中樞神經系統網絡聯系受損，認知功能及記憶能力的下降。因此，改善突觸相關蛋白表達和功能障礙是改善認知缺陷和防止AD發展的一個重要目標[5-6]。

山茱萸環烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside, CIG)是從傳統補腎中藥山茱萸中提取的主要有效成分。CIG對APP/PS1/tau三轉基因(3×Tg)動物模型具有改善學習記憶能力的作用，其主要機制為增高神經營養因子含量、減少Aβ沉積、抑制tau蛋白的病理改變[7]。本實驗進一步研究CIG對模型小鼠腦內突觸相關蛋白的影響，并探討不同月齡3×Tg小鼠的腦內突觸及其影響因素的變化特點。

1 材料與方法

1.1 藥物

CIG(批號：071207)，由首都醫科大學宣武醫院藥物研究室自行研制。山茱萸為市售(產地河南西峽)，經水提、醇沉、大孔吸附樹脂層析，提取和分離獲得CIG，純度為70%(其中莫諾苷含量為67%，馬錢苷含量為33%)達到國家中藥、天然藥物5類新藥的要求。CIG為棕黃色粉末，水溶性好。實驗中采用干粉劑量，溶解于蒸餾水，制成藥液應用。

1.2 動物分組及給藥

3×Tg小鼠，購自美國Jackson Lab公司，經過首都醫科大學宣武醫院藥物研究室擴增繁殖，每只均經過基因型鑒定。實驗動物許可證號：SYXK(京)2015-0016。動物飼養環境是開燈/關燈每天各12 h，恒溫(23±1) ℃，食物和水自由攝取。

(1) 7月齡：對照組：野生型(wild type,WT)小鼠11只；模型組：3×Tg小鼠11只；給藥組：3×Tg+CIG 200(200 mg/kg)11只。每日1次灌胃給予等體積CIG或者蒸餾水，從7月齡持續至9月齡。

(2)16月齡：對照組： WT小鼠8只，WT+CIG低劑量組(100 mg/kg)9只；模型組：3×Tg小鼠7只；藥物治療組：3×Tg+CIG低劑量組(100 mg/kg)7只，3×Tg+CIG高劑量組(200 mg/kg)7只。每日1次灌胃給予等體積CIG或者蒸餾水，從16月齡持續至18月齡。

1.3 試劑與儀器

兔抗淀粉樣前體蛋白(amyloid precurson protein,APP)抗體(1∶500), 兔抗IDE抗體(1∶10 000), 兔抗Bace1抗體(1∶10 000), 兔抗tau-5抗體(1∶1 000)，購自美國Abcam公司；兔抗ADAM10抗體(1∶10 000), 兔抗PS1抗體(1∶10 000), 兔抗Synapsin I 抗體(1∶1 000), 兔抗Synaptophysin抗體(1∶1 000), 兔抗Synaptotagmin 抗體(1∶1 000)，購自美國Sigma公司; 兔抗tau-Ser404抗體(1∶1 000), 兔抗tau-Ser199/202抗體(1∶1 000)，購自美國Invitrogen公司；小鼠抗β-actin抗體(1∶2 000)，購自美國Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，美國Santa Cruz公司。FluoChem化學發光凝膠成像系統，購自美國Protein Simple公司；圖像分析系統：Image-pro Plus型，購自美國Media Cybernetics公司；電泳儀：PowerPac200型，購自美國BIO-RAD公司。

1.4 新物體識別實驗

利用嚙齒類動物喜歡對新的物體進行探測的行為來判斷動物是否記住先前遇到過的舊物體，如果記住舊的物體，則動物應對舊物體的探索時間少于新的物體。結果用分辨指數來表示，分辨指數越高表示動物的學習記憶能力越好，反之，則學習記憶能力差。實驗主要分為適應期、熟悉期和識別期。第1天為適應期：小鼠放于良好光線照射的方盒中(燈要放置于盒子的上方，不能偏離兩端)，自行適應性活動10 min。第2天為熟悉期：在方盒中放入2個相同的紅色塑料瓶(4 cm×4 cm)，距離邊壁8 cm，讓小鼠在盒中10 min，記錄其在每個物體上的探索時間(以鼠的嘴湊近物體<0.5 cm，嘴的方向必須對著物體才計入，站在玩具上玩不能計入)。每只秒表對應1個物體計時。第3天為識別期：將另外一個棕色玻璃瓶放入方盒，替換其中的一個舊物體(注意要依次更換替代物體的位置)，測定小鼠探索每個物體的時間。計算統計第3天各組小鼠在新物體上的分辨指數，公式為：分辨指數=(新物體時間-舊物體時間)/(新物體時間+舊物體時間)。

1.5 免疫印跡法

取出腦組織后置于冰上將海馬及皮質分離后，放入液氮中速凍，于-80 ℃保存。將凍存于-80 ℃冰箱中的小鼠海馬/皮質組織取出并稱質量，加入裂解液裂解，之后提取蛋白并定量。蛋白經 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉至PVDF 膜上，與上述一抗、二抗孵育后，在暗室將超級化學發光底物 A 液與 B 液等量混合，立即加到膜上，0.8 mL /膜，滴勻液體，反應 2 min，然后用濾紙吸去多余熒光劑，將膜放到化學發光凝膠成像儀中曝光 10 s～5 min。將圖片存為TIFF格式。選擇曝光度適中，條帶較為清晰的TIFF圖片采用TINA軟件進行分析。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 CIG對3×Tg小鼠記憶功能的影響

7月齡組內各觀察組間小鼠分辨指數差異無統計學意義(P>0.05)。16月齡組內各觀察組間小鼠分辨指數，差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，3×Tg小鼠分辨指數明顯低于對照組(P<0.05)；CIG(200 mg/kg)灌胃給藥2個月使16月齡3×Tg小鼠的物體分辨指數顯著提高(P<0.05)，詳見表1。

表1 CIG對3×Tg小鼠分辨指數的影響 Tab.1 Effect of CIG on discrimination

n=7-11 per group；#P<0.05vsWT group，*P<0.05vs3×Tg group；WT: wide type;3×Tg:APP/PS1/tautransgenic mice;3×Tg+CIG200:APP/PS1/taumice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;CIG: cornel iridoid glycoside.

2.2 CIG對3×Tg小鼠腦內突觸相關蛋白表達的影響

7月齡組內各觀察組間小鼠腦內主要突觸相關蛋白synapsin-1、synaptotagmin、synaptophysin表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖1。16月齡組內各觀察組間小鼠腦內主要突觸相關蛋白synapsin-1表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，3×Tg小鼠腦內synapsin-1表達量明顯低于對照組小鼠(P<0.01)，CIG可以提高其表達(P<0.01)。而synaptotagmin和synaptophysin表達水平，各組間差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖2。

圖1 CIG對7月齡組3×Tg小鼠腦內突觸相關蛋白的影響

圖2 CIG對16月齡3×Tg小鼠腦內突觸相關蛋白的影響

2.3 CIG對7月齡3×Tg小鼠腦內APP及其代謝相關蛋白的作用

應用Western blotting法檢測7月齡3×Tg小鼠皮質APP及其代謝相關蛋白的作用，全長APP(full length amyloid-β precursor protein, FL APP)、α分泌酶(recombinant a disintegrin and metalloprotease 10, ADAM10)、β分泌酶(β-site APP-cleaving enzyme 1, BACE1)、γ分泌酶成分蛋白(preclinical presenilin1, PSEN1)、胰島素降解酶(insulin degrading enzyme, IDE)的表達在模型組與對照組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，給與CIG后對模型動物無影響(圖3)。

圖3 CIG對7月齡3×Tg小鼠腦內APP及其代謝相關蛋白的影響

2.4 CIG對7月齡3×Tg小鼠腦內tau蛋白過度磷酸化的影響

應用Western blotting法對7月齡小鼠大腦皮質tau蛋白蘇氨酸(Ser)199/202位點和絲氨酸(Ser)404位點的磷酸化水平進行了檢測。7月齡3×Tg小鼠皮質tau蛋白磷酸化水平和對照組小鼠相比并未發生明顯改變，且給予CIG治療組也未發生變化，差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見圖4。

圖4 CIG對7月齡3×Tg小鼠腦內tau蛋白磷酸化的影響

3 討論

AD是一種神經退行性疾病，在癡呆中較為常見，臨床以記憶障礙最為常見。患者腦內出現由beta-淀粉樣蛋白(beta-amyloid peptide，Aβ)聚集形成的老年斑(senile plaques，SP)，并伴隨突觸丟失、突觸相關蛋白的減少[8-9]。選擇能夠貼近AD發病臨床表現的動物模型對于疾病的研究和新藥藥效評價至關重要。3×Tg小鼠能夠呈現AD的主要神經病理學特征，出現大腦神經元死亡、突觸丟失等 AD 的重要病理變化，能真實地模擬AD臨床過程和病理改變[10]。

AD患者腦額葉和頂葉突觸蛋白水平與正常同齡人相比，synaptotagmin，synapsin-1[11]，synaptophysin明顯下降[12]。目前已在AD患者腦內檢測出有大量突觸丟失，而且突觸丟失與AD患者認知功能下降密切相關[13]。可見，在AD腦內突觸相關蛋白表達水平發生異常變化，導致突觸傳遞受損，從而影響認知功能。神經遞質釋放受多種突觸前蛋白調控。本實驗結果顯示7月齡3×Tg小鼠學習記憶功能沒有發生明顯的損傷，而且腦內突觸相關蛋白synapsin-1、synaptophysin及synaptotagmin也沒有明顯的增加。16月齡模型小鼠不僅學習記憶功能明顯降低，且腦內synapsin-1也明顯減少。Synapsin-1是第一個被確定的突觸前蛋白也是突觸囊泡上含量最豐富的蛋白[14]。本研究結果提示synapsin-1在此轉基因小鼠發病過程中更容易受到致病因素的影響從而發生改變。

腦內Aβ和tau蛋白異常過度磷酸化能夠減少突觸相關蛋白的表達[15]。Aβ 是由其前體蛋白APP 經BACE1分泌酶水解產生的。ADAM-10將APP水解成具有神經營養作用sAPPα，不產生Aβ。IDE在腦內能夠降解Aβ以及APP胞內段，其降解產物喪失聚集以及沉積能力，毒性降低[16-17]。研究[18]顯示，IDE的表達受早老素1(presenilin-1，PS1)多變體的影響，并且隨著PS1的增多，IDE的表達和活性有所降低，導致Aβ42水平的增加。本實驗在7月齡3×Tg小鼠腦內APP及其代謝蛋白和tau蛋白的磷酸化沒有明顯的改變，但本課題組[7]前期實驗發現16月齡小鼠腦內具有明顯的Aβ沉積和tau蛋白異常過度磷酸化。這提示，APP和tau在7月齡小鼠腦內未出現異常變化，所以不能引起突觸相關蛋白的改變。

研究[19]顯示，3×Tg小鼠在6月齡即出現APP及tau蛋白的異常，但本實驗在7月齡3×Tg小鼠腦內沒有Aβ和tau蛋白的異常表達。轉基因小鼠出現病理變化受小鼠品系背景影響。研究[20]顯示，C57BL/6J對于APP基因過表達更加易感，比以DBA/2為背景的轉基因小鼠更早出現Aβ相關的病理變化。本實驗采用的3×Tg小鼠以129小鼠為背景，因此推斷其對APP等基因的易感性弱于C57BL/6J小鼠，因此出現相關病理變化較晚。

Synapsin-1與軸突的延長和突觸囊泡融合動力學的調節有關，并且在突觸行程中扮演重要角色[21]。神經遞質釋放前，囊泡通過synapsin-1蛋白連接至細胞骨架上，Ca2+內流，突觸囊泡從細胞骨架解離，進入突觸前膜的活性區，經過一系列的錨定、裝配，鈣離子傳感器synaptotagmin-1由于受到鈣離子信號，在synaptophysin的參與下觸發囊泡融合，最終以胞吐方式釋放囊泡內神經遞質[22-24]。16月齡小鼠給予CIG 2個月，能夠增加synapsin-1的表達，提高模型動物學習記憶功能，提示CIG能夠促進突觸形成、囊泡釋放及神經遞質傳遞，這可能是CIG改善AD模型動物認知障礙的機制之一。

綜上所述，本實驗研究了7月齡及16月齡3×Tg小鼠腦內突觸相關蛋白及其致病因素的變化，為實驗中選擇合適月齡及品系的模型動物提供參考。CIG能夠增加16月齡3×Tg小鼠synapsin-1表達，為明確CIG改善AD模型動物認知障礙的機制提供實驗依據。