上尿路尿路上皮癌Slit引導配體3的表達與臨床病理特征以及預后的關系

吳西抗 王 躍 賀慧穎*

(1. 北京大學醫學部病理系 北京大學第三醫院病理科,北京 100191；2. 北京大學首鋼醫院病理科,北京 100144)

尿路上皮癌(urothelial carcinomas，UCs)是第四大常見的腫瘤[1-2]。UCs可以發生在下尿路(膀胱和尿道)或上尿路(腎盂和輸尿管)。其中膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BUC)占UCs的90%～95%，是最常見的尿路上皮惡性腫瘤[3]。上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma, UTUC)在全球范圍內是一種相對少見的、具有高復發率和進展率的惡性侵襲性腫瘤，約60%的UTUC患者在診斷時腫瘤已發生浸潤[2]。在西方國家，UTUC占所有尿路上皮惡性腫瘤的5%～10%，其發病率約為2/100 000[2]。在中國，UTUC流行病學和臨床特點與西方國家有明顯的差異，表現為發病率較高，UTUC的發病率約為8/100 000，約占尿路上皮癌的20%～30%；且更好發于女性，男女比例為1∶1.3，而在歐洲國家男女比例約為3∶1；輸尿管UTUC的發病率為西方國家的2倍；相對于男性患者，女性患者具有分期高、體積大和淋巴結轉移率高的臨床特點；在中國，主要的危險因素為服用含有馬兜鈴酸的中藥，而在西方國家為煙草[2, 4-5]。鑒于UTUC在中國具有特殊的發病情況，因此尋找國人UTUC的預后因素具有重要的意義。以往的報道表明，Slit引導配體3(Slit guidance ligand 3，Slit3)在甲狀腺癌[6]、惡性黑色素瘤[7]及結直腸癌[8]等腫瘤中起抑癌作用。本研究通過檢測UTUC標本中Slit3的表達情況，探究Slit3表達與UTUC患者臨床病理特征和預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2007年1月至2017年3月在北京大學首鋼醫院和北京大學第三醫院行腎輸尿管根治術的90例UTUC患者的常規石蠟標本及臨床病理資料，患者術前或術后均未接受化學藥物治療(以下簡稱化療)，部分患者在復發或轉移時接受了放射治療。所有病例的病理信息均經兩位泌尿病理醫生獨立評價。根據第8版AJCC腎盂和輸尿管癌TNM分期[9]對病例進行分期。按照2016年WHO泌尿系統腫瘤分類對病例進行分級[10]。

1.2 組織微陣列(tissue microarrays，TMA) 的構建

TMA由90例UTUC樣本和12例腫瘤周邊的正常尿路上皮樣本組成。基于先前的研究[11]，每個病例人工選擇3個直徑為2 mm的最佳腫瘤區域，通過手動式取樣槍將其精確地排列到預制的TMA石蠟塊中。

1.3 免疫組織化學方法

免疫組織化學染色采用EnVision兩步法，用PBS代替一抗作為陰性對照，以正常尿路上皮作為陽性對照，使用兔抗人Slit3多克隆抗體(上海BBI生命科學有限公司；1∶200，4 ℃濕孵過夜)及二抗(HRP-抗鼠抗兔IgG，丹麥DAKO公司)進行染色。免疫組織化學檢測結果由兩名病理醫師采用雙盲法閱片，由于腫瘤細胞染色表現為胞質染色全或無，故僅根據細胞染色強度判定。按染色強度計分：無陽性著色計為0分，淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。在后續的數據分析中，0分和1分歸為低表達組，2分和3分歸為高表達組。

1.4 隨訪

每六個月更新患者隨訪數據，直至2017年6月。其中10名患者在手術后失訪，最終有80例進行生存分析，中位隨訪28個月(1～101個月)。定義術后膀胱復發為在膀胱鏡復查中發現膀胱腫物，并通過病理學確認。無病生存期(disease free survival，DFS)定義為UTUC手術與死亡之間的間隔。因UTUC發生死亡為事件，因其他原因死亡或仍存活的患者在末次隨訪時為刪失。癌特異性生存期(cancer-specific survival，CSS)定義為從疾病診斷之日起到疾病出現復發、轉移的時間。

1.5 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件對所有數據進行統計學分析，分類變量組間比較采用卡方檢驗和Fisher確切概率法；兩個因素之間的相關性采用Spearman等級相關分析；Pearson相關分析用于檢驗Slit3表達和UTUC臨床病理特征的關系；生存分析單因素采用Kaplan-Meier法，多因素分析采用Cox回歸模型。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征

本研究共納入UTUC病例90例，患者發病年齡為41～88歲，平均年齡(68±9)歲，中位年齡為70歲。女性患者36例，男性患者54例。發生在左側上尿路43例，右側上尿路47例。其中發生在腎盂者38例，腎盂輸尿管連接處1例，輸尿管共6例，三處均有共6例。影像學等資料均未顯示伴有膀胱癌。腫瘤最大徑<3 cm者共51例，最大徑≥3 cm者共39例。13例為多灶分布。高級別UTUC 64例，低級別UTUC 26例。Ta～T1期患者共38例，T2～T4期患者共52例，其中伴有腎小球硬化的27例。腫瘤伴有大片壞死者10例。具有神經侵犯者5例，有淋巴結轉移者9例。發生膀胱復發的18例。

2.2 Slit3在UTUC中的表達

Slit3陽性定位于細胞質，呈棕黃色或褐色顆粒狀，在癌旁正常尿路上皮中均呈強陽性。在90例UTUC中，44例為高表達，46例為低表達。在Slit3高表達的病例中，26例為高級別UTUC，18例為低級別UTUC；在Slit3低表達的病例中，38例為高級別UTUC，8例為低級別UTUC(圖1)。

2.3 Slit3表達與UTUC臨床病理特征的關系

圖1 免疫組織化學染色結果

UTUC中Slit3表達與組織學分級(P=0.014)、腫瘤分期(P=0.006)相關，表明Slit3低表達的UTUC患者往往具有更高的組織學分級以及更晚的病理分期；同時Slit3低表達者具有更高的術后膀胱復發率。而Slit3表達與患者年齡、性別、腫瘤發生部位、脈管內癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移、壞死和多灶分布等無關(表1)。

2.4 Slit3與UTUC患者預后的關系

Kaplan-Meier單因素分析顯示Slit3低表達的UTUC患者其DFS為45.5個月；而高表達組其DFS為84.0個月，二者差異有統計學意義(P=0.006)(圖2A)。此外Slit3低表達的UTUC患者其CSS為58.6個月，而高表達組其CSS為84.9個月，二者差異也有統計學意義(P=0.015)(圖2B)。進一步，分別以CSS、DFS為因變量，表1中的因素為自變量進行多因素Cox回歸分析，結果Slit3的表達狀態對UTUC患者DFS和CSS的影響差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

3 討論

UTUC在歐美國家是一種相對少見的惡性腫瘤，然而在中國UTUC的發病率約為歐美國家的2～3倍，且預后相對較差，且具有較為特殊的臨床表現，如女性相對常見、與含有馬兜鈴酸的中藥等具有相關性[2]。臺灣學者Lee等[12]對2例高級別UTUC女性患者的腫瘤組織和正常組織進行二代測序分析，首次發現在高級別UTUC中Slit3呈低表達，因此在90例國人UTUC患者中對Slit3的表達與患者臨床病理特征及預后的關系進行探討。

Slit3最早發現于黑腹果蠅中[13]，隨后在果蠅的中樞神經系統也發現了Slit3，并成功克隆[14]。在脊柱動物中Slit3具有3種同源亞型，分別為Slit1、Slit2和Slit3，其中Slit3由N末端信號肽、1個層黏連蛋白-G樣結構域、4個富含亮氨酸的重復單位D1～D3、9個表皮生長因子重復序列和C末端半胱氨酸結構域組成，具有高度保守性[15]。Robo是Slit3的單跨膜受體，又稱Robo受體。在哺乳類動物中，Robo受體具有4個亞型，分別為Robo1、Robo2、Robo3和Robo4。正常生理狀態下，Slit3廣泛表達于腦、心、肝、腎、骨骼肌等組織器官的線粒體中，通過和Robo4受體參與多種器官形成等生理功能。除此之外，Slit3還表達于血管內皮細胞和平滑肌細胞，具有較強的促血管生成的作用[16-17]。

表1 Slit3表達與UTUC臨床病理特征的關系

*n=80;Slit3： Slit guidance ligand 3;UTUC: upper tract urothelial carcinoma.

圖2 表達不同Slit3 UTUC患者Kaplan-Meier 生存曲線

病理狀態下，Slit3在多種實體瘤中均有表達，參與腫瘤細胞的運動、生長及侵襲等生物學行為[18-19]。總體上Slit3發揮抑癌的作用，如Yu等[8]研究顯示，在結直腸癌組織中，Slit3基因表達水平低于正常組織；在透明細胞性腎細胞癌和甲狀腺癌中Slit3均表現為基因表達水平下調[6,20]；此外也有研究[7]顯示Slit3參與組成的肽合物可以抑制惡性黑色素瘤細胞的侵襲能力。

基于以上的發現，筆者進一步研究及驗證Slit3在UTUC中的表達及意義。結果顯示與Slit3高表達的UTUC患者相比，Slit3低表達者往往具有組織學分級高、腫瘤分期晚和膀胱復發率高的特點。同時Slit3低表達的患者往往具有較低的DFS和CSS。但多因素分析顯示Slit3并非UTUC的獨立預后因素。

表2 影響 UTUC患者CSS、DFS的多因素COX分析

有研究顯示Slit3作為miR-218-2的宿主基因，二者能夠發揮協同作用，抑制多種腫瘤，如甲狀腺癌[6]、結直腸癌[8]和胃癌[19]等腫瘤細胞的增生、遷移和轉移。但目前并未發現在UTUC中存在miR-218-2的表達異常[10]，提示有其他的miRNA 參與Slit3對腫瘤細胞生物學的調控。有報道[21]顯示Slit3的表達與腫瘤的分子亞型有關，如在EB病毒陽性和微衛星不穩定亞型的胃癌中表達降低，而在基因組穩定亞型的胃癌中表達升高。最近有研究[22]顯示UTUC可分為四種具有不同生物學行為的分子亞型，而Slit3是否與UTUC分子亞型相關，則需進一步深入研究 。