萵筍霜霉病抗性材料選育方法

李家慧，徐冬梅，黃海濤，文 靜，王治斌，牛義松，張 杰

(四川省綿陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 綿陽 621023)

萵苣(Lactucasativa L.)屬菊科(Compositae)萵苣屬(Lactuca L.)，根據(jù)產(chǎn)品器官分為莖用萵苣和葉用萵苣，其中莖用萵苣又稱萵筍、青筍和萵苣筍等。喜冷涼氣候，是四川種植面積較大的蔬菜種類之一。隨著市場需求的增多和品種類型的不斷豐富，在四川平壩地區(qū)可四季種植。霜霉病是四川地區(qū)萵筍的主要病害，一般在冬春季節(jié)，特別是早春陰雨天發(fā)病較重，若防治不當(dāng)，可造成減產(chǎn)10%以上，甚至絕收。市場上尚無抗霜霉病的萵筍品種，使得生產(chǎn)上仍以藥劑防治為主，不僅增加了生產(chǎn)投入，還不利于萵筍的無公害生產(chǎn)。

抗病育種在國內(nèi)其他蔬菜上早有應(yīng)用，王惠哲等[1]通過苗期人工接種抗病性鑒定，篩選出黃瓜褐斑病高抗材料3份和抗病材料2份。但是，關(guān)于萵筍抗性鑒定和抗源篩選進(jìn)展尚未見報，尤其是萵筍抗病育種方面在國內(nèi)幾乎是空白。在國外，Michelmore[2]研究表明萵苣對霜霉病的抗性是由顯性單基因控制。分子標(biāo)記輔助選育研究，能針對市場需求高效地選擇優(yōu)良品種，這對蔬菜育種效率具有很大的提升，如劉秀村[3]利用RAPD標(biāo)記并結(jié)合BSA法，在大白菜DH群體中篩選出與桔紅心基因連鎖的標(biāo)記。本文詳細(xì)介紹了通過雜交技術(shù)培育萵筍抗霜霉病新材料的操作方法，以及利用分子標(biāo)記輔助育種和田間鑒定相結(jié)合的抗性鑒定方法，可提高目標(biāo)資源鑒選效率和準(zhǔn)確性，加快抗性材料選育的獲得和品種選育進(jìn)程。

1 抗性鑒定

萵筍霜霉病在田間遇到連續(xù)陰雨天氣，就會快速蔓延擴(kuò)展。四川地區(qū)在冬春季節(jié)種植的萵筍發(fā)病較多。選育抗霜霉病材料，在該病害流行季節(jié)，將所選材料放在病圃里，使感病生育期與病害發(fā)生流行時期相吻合，采用自然誘發(fā)和人工接種結(jié)合進(jìn)行鑒選，按照萵筍霜霉病病害分級法分級(見表1)進(jìn)行田間調(diào)查。

表1 萵筍霜霉病病害分級標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)其病情指數(shù)，按照感染霜霉病的程度(高抗、抗病、中抗、感病、高感)(見表2)篩選優(yōu)良株系或單株留種。

表2 萵筍霜霉抗性型劃分標(biāo)準(zhǔn)

2 雜交季節(jié)選擇

四川地區(qū)萵筍雜交在春秋兩季均可進(jìn)行，一般選擇春季。因為，春季溫度較適宜，萵筍由陸續(xù)開花到盛花期時間較長，保證了充足的雜交時間。春季雜交的播種時間為9月中下旬至10月上中旬，定植時間為10月中下旬至11月下旬，翌年4月上旬便可開始雜交。露地雜交最適宜時間集中在4月中下旬至5月上中旬，5月下旬開始，溫度升高，萵筍開花快，不利于去雄。

四川地區(qū)秋季也可進(jìn)行雜交，但秋季雨水多，露地雜交較難開展，效果也較差。一般選擇在大棚種植，播種時間為7月份，雜交時間為9月中下旬。秋季種植大棚萵筍，開花期易遭到果實蠅為害花蕾，所以在花期前要做好防治。與春季相比，秋季花期短，結(jié)籽受光照影響較大，效果不如春季。

3 剝離法雜交

3.1 時間

由于萵筍花的結(jié)構(gòu)特別、開花時間短，導(dǎo)致雜交難度很大。萵筍的花為舌狀花、花小，柱頭包裹在花藥里面，一朵花由20多朵舌狀小花組成，它屬于高度自交作物，有研究認(rèn)為萵苣的自然雜交率不到3%[4]。其花無法在蕾期去雄，只能在開花期進(jìn)行，因為一朵花的花期僅持續(xù)2～2.5h。萵筍開花時間隨著溫度和光照的不同而變化，一般晴天溫度越高，則開花時間越早，根據(jù)天氣情況，晴天的最佳去雄授粉時間為早上7:00～8:30，一般情況下，最佳去雄授粉時長為1.5h左右，在晴天的早上，每人每天可完成40～50朵花的雜交；陰雨天氣，萵筍在上午10:00后開花，陰雨天由于花粉上有水珠，不利于去雄，所以選擇在晴天早上進(jìn)行雜交。

3.2 雜交方法

3.2.1 去雄 晴天的上午9:30之前，選取母本植株花朵花冠伸出但未展開前，食指和中指夾住花托底部，用力向花朵中心吹一口氣，使每一朵小花的花冠散開，露出花藥管，便于去雄。手持小鑷子輕輕夾住花藥管中上部，向外拔出，只拔出花藥管，用力要均衡，用力過大，會將花藥管里面的柱頭一起拔出，拔出花藥管后，可以看到柱頭。萵筍花是有20多朵舌狀小花組成，分2～3輪排布，需仔細(xì)檢查每一朵舌狀小花的花藥管是否去除干凈，如果有拔斷或損壞的花藥管殘留在小花中，則將整個舌狀小花去除。去除花藥管的過程要小心，避免損傷整朵花，不利于結(jié)籽。

3.2.2 沖洗 整朵小花的花藥管徹底去除干凈后，用小噴壺向整朵花噴清水沖洗，沖洗散落、殘留的花粉。之后，用力向花朵吹氣，吹掉花朵內(nèi)的水珠，再將去雄后的花朵反復(fù)沖洗3～4次，每次均要吹掉花朵內(nèi)的水珠。最后，給去雄的花朵罩上防蟲網(wǎng)袋，避免蜜蜂或其他昆蟲飛落在上面，沾染了其他花粉。

3.2.3 授粉

等待整朵花水珠完全干后，雌蕊柱頭呈“Y”字狀展開，采摘完全開放的父本花朵，給去雄后的母本授粉，拿父本花朵在去雄后的母本花朵上輕輕蘸1～2次，可以看到黃色的花粉沾到母本花的柱頭上，即完成授粉。在授粉后的母本花花托部位系一根細(xì)繩作為雜交標(biāo)記，并掛上標(biāo)記牌。授粉后，花朵不會馬上閉合，要罩上防蟲網(wǎng)袋。在授粉后的10～15d可以采收萵筍雜交種子。

4 分子標(biāo)記

在萵筍霜霉病田間抗性鑒定和誘導(dǎo)發(fā)病的基礎(chǔ)上，選取抗病株系作為父本，和感病株系作為母本進(jìn)行雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2分離群體，對分離群體中的100個子代和2個親本開發(fā)高密度分子標(biāo)簽，進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建和相關(guān)性的QTL關(guān)聯(lián)分析，獲得與性狀緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)簽和候選區(qū)域。利用遺傳圖譜進(jìn)行QTL定位，比較基因組，輔助基因組組裝等科研工作，這不僅拓寬了育種手段，同時加快了育種進(jìn)程。

5 應(yīng)用

通過對6份材料進(jìn)行雜交，抗病材料2份，感病材料1份，獲得了330份雜交組合，其中，抗病性較好的優(yōu)良組合8份。通過遺傳圖譜構(gòu)建和相關(guān)性狀的QTL關(guān)聯(lián)分析，獲得了與性狀緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)簽和候選區(qū)域，構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，明確了霜霉病在萵筍中遺傳規(guī)律，為加快品種選育進(jìn)程和抗病材料的高效利用提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。