HBV相關慢加急性肝衰竭患者糖皮質激素受體表達特征及其與療效的關系

董金玲， 賈 琳， 楊 君， 于紅衛， 胡中杰， 朱躍科， 孟慶華

首都醫科大學附屬北京佑安醫院 肝病重癥醫學科， 北京 100069

HBV相關慢加急性(亞急性)肝衰竭(hepatitis B virus related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是我國臨床最為常見的肝衰竭類型。糖皮質激素(glucocorticoid，GC)治療HBV-ACLF在國內外研究中仍存在很大爭議[1]，GC與糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)結合后才能發揮其生物學效應。不同研究表明GC敏感性與GR亞型表達相關，本研究采用前瞻性、非隨機對照入組的研究方法，通過檢測GR及其亞型GR-α、β的表達，探討GC治療HBV-ACLF早、中期患者GR亞型表達特征及其與療效的關系，為GC在臨床中的科學合理應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 入組2015年9月-2018年6月于本院住院治療的HBV-ACLF患者38例，剔除2例行肝移植者，3例存活超28 d，但未完成28 d觀察研究者，剩余33例納入研究，分為激素組(18例)和非激素組(15例)；激素組根據患者應用7 d短療程激素后，在第10 d時的臨床癥狀及實驗室指標，分為激素敏感組 (13例) 和激素不敏感組 (5例)。

1.2 納入標準 年齡18～70歲，性別不限；HBV-ACLF早、中期診斷符合《肝衰竭診治指南(2012年版)》[1]診斷標準：(1)極度乏力，有明顯的消化道癥狀；(2)黃疸迅速加深，血清TBil≥171 μmol/L或每日上升≥17.1 μmol/L；(3)出血傾向， 20%

1.3 排除標準 合并其他病毒感染；入組前2個月不可控制的細菌、真菌感染或胃腸道出血者；自身免疫性疾病，酒精性肝病，藥物性肝炎，嚴重的心臟、腎臟、呼吸系統、神經系統疾病，腫瘤性疾病，其他禁忌激素類藥物治療的疾病(如活動性潰瘍病、肺結核等)。

1.4 方法

1.4.1 觀察時間點及觀察指標 (1)于入院、8 d、10 d、14 d、28 d觀察：①患者一般狀況、消化道癥狀、腹水、肝性腦病、消化道出血等情況變化；②肝、腎功能、凝血功能等。(2)于入院、8 d檢測GR及GR-α mRNA、GR-β mRNA表達。

1.4.2 治療方案 (1) 內科綜合治療：保肝、抗病毒(恩替卡韋或富馬酸替諾福韋酯)、補充血漿及人血白蛋白、防治感染及并發癥、人工肝治療(應用激素前后10 d未行血漿置換)等。(2) 激素組在內科綜合治療基礎上給予甲基強的松龍(輝瑞制藥有限公司，Pfizer，NYSE：PFE)1.5 mg·kg-1·d-2，3 d；1 mg·kg-1·d-2，2 d；0.5 mg·kg-1·d-1，2 d，靜脈滴注，總療程7 d。

1.4.3 激素敏感性療效評價標準及分組 (1)激素療效反應敏感者：一般觀察指標明顯改善，PTA>40%或PTA較基線上升>30%，且TBil<10×正常值上限(ULN)或TBil較基線下降>30%[2]。(2)激素療效反應不敏感者：一般觀察指標無改善或較前惡化，TBil和PTA未達激素反應敏感療效者，或評價時間點前發生死亡者。激素反應療效敏感者歸為激素敏感組，不敏感者歸入激素不敏感組。以上標準制訂參考已發表的文獻和臨床實際工作經驗。

1.4.4 GR及GR-α mRNA、GR-β mRNA測定 使用流式細胞儀(美國，BeckmanFC500)、流式CD3抗體、固定劑、封閉液、破膜劑(美國,Ebioscience公司)、GR單抗及IgG同型對照(美國,Abcam公司)檢測外周血T淋巴細胞GR表達。使用RT-PCR儀(美國,BIORAD)；cDNA合成試劑盒 (TaKaRa公司)、SYBRPremixExTaq及RT-PCR引物檢測外周血GR mRNA亞型表達。引物設計及合成，GR-α、GR-β引物設計參照文獻[3]，GAPDH引物為大連寶生物公司設計合成(表1)。

表1 引物序列

目的基因的表達水平用2-ΔCt表示，ΔCt=待測標本目的基因的Ct值- 待測標本內參基因的Ct值。每一標本的檢測各重復兩孔，取兩復孔檢測的平均值，同時做陰性對照，質控監測，保證實驗準確。

1.5 倫理學審查 患者均簽署知情同意書，本研究已通過首都醫科大學附屬北京佑安醫院倫理委員會批準，并備案(批號：京佑科倫字〔2018〕020號)。

2 結果

2.1 2組患者基線資料比較 激素組男17例，女1例，非激素組15例均為男性。2組患者基線時年齡、發病至入組時間、TBil、PTA、MELD評分、HBV DNA定量、基線皮質醇水平、感染(腹膜炎、肺炎、膽系感染等)及并發癥(漿膜腔積液、肝性腦病、消化道出血、電解質紊亂、急性腎損傷)發生情況差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表2)。33例HBV-ACLF患者在28d時共有27例(81.82%)存活，6例(18.18%)死亡，生存曲線顯示，激素組與非激素組28 d生存情況差異無統計學意義(88.89%vs 66.67%，P=0.104)；28d激素組主要死亡原因為感染中毒性休克(1例)和肝、腎功能衰竭(1例)，非激素主要死亡原因為消化道出血(1例)、肝性腦病(1例)、感染中毒性休克(1例)和肝、腎功能衰竭(1例)，激素組與非激素組死因差異無統計學意義(P>0.05)。28 d時激素敏感組12例存活(92.3%)，激素不敏感組4例存活(80%)，激素敏感組在第11天時死亡1例，激素不敏感組在第20天時死亡1例。

2.2 2組不同時間點肝功能及凝血指標動態變化比較 激素組與非激素組各指標不同時間點比較,發現激素組TBil明顯低于非激素組[8 d:(237.21±142.11) μmol/L vs (385.92±136.66) μmol/L,t=-3.045，P=0.005;10 d:(247.93±173.16) μmol/L vs (393.29±175.76) μmol/L，t=-2.292，P=0.029]。激素組PTA明顯高于非激素組(8 d: 52.10%±19.38 %vs 38.52%±12.64%，t=2.329，P=0.027;10 d: 58.40%±20.23% vs 38.52%±12.64%，t=2.329，P=0.027;14 d: 62.17%±22.98% vs 43.85%±13.09%，t=2.484，P=0.019]。而ALT、AST和Alb在各隨訪點兩組間未見明顯統計學差異(P值均>0.05)。

2.3 2組患者GR及亞型表達比較 2組基線時GR、GR-αmRNA和GR-β mRNA比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)。激素組8 d時GR-α mRNA和GR-β mRNA表達水平較基線明顯降低(t值分別為6.586、1.601，P值分別為<0.001、0.128)；且8 d時GR-α mRNA表達水平激素組明顯低于非激素組(P=0.001)(表3)。

2.4 激素敏感組與激素不敏感組不同時間點肝功能及凝血指標動態變化 在不同時間點，激素敏感組TBil和PTA指標改善明顯優于激素不敏感組(P值均<0.05)(表4、5)。

表3 2組GR及其亞型比較

注：與基線GR-α mRNA比較，1)P<0.05；與基線GR-β mRNA比較，2)P<0.05。

表4 激素敏感與不敏感組不同時間點TBil比較

表5 激素敏感組與不敏感組不同時間點PTA比較

2.5 激素敏感組與激素不敏感組基線及8 d時GR及GR-α和GR-β mRNA比較 激素敏感組與激素不敏感組患者基線比較，GR表達水平(88.02%±6.31% vs 89.38%±6.90%)、 GR-α mRNA表達水平[(1.95±0.59)×10-2vs (1.97±0.09)×10-2]、 GR-β mRNA表達水平[(0.20±0.11)×10-2vs (0.11±0.04)×10-2]差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

激素敏感組與激素不敏感組患者8 d比較，2組GR表達水平差異無統計學意義(86.70%±6.20% vs 88.42%±8.46%，t=-0.477，P=0.640)； GR-α mRNA表達水平在激素敏感組明顯高于激素不敏感組[(1.21±0.34)×10-2vs (0.43±0.31)×10-2，t=4.456，P<0.001](圖1)；GR-β mRNA表達水平在激素敏感組[(0.14±0.08)×10-2]與激素不敏感組[(0.10±0.04)×10-2]比較差異無統計學意義(t=1.092，P=0.291)(圖2)。

2.6 激素敏感組與不敏感組患者GR-α mRNA及GR-β mRNA 水平 8 d時較基線下降幅度比較 激素敏感組GR-α mRNA表達降低幅度明顯小于激素不敏感組(t=-2.904，P=0.010)；GR-β mRNA下降幅度在2 組間差異無統計學意義(t=0.665，P=0.516)(圖3、4)。

2.7 激素組不同GR-α mRNA表達水平與TBil和PTA變化的關系 8 d時激素組患者GR-α mRNA表達降低幅度與基線的比值均值為46%，據此分為≤46%組(10例)和>46%組(8例)。2組GR-α mRNA表達水平降低幅度與基線的比值差異有統計學意義(26.99%±25.09% vs 70.09%±16.08%，t=-4.203，P=0.001)。

10 d時，TBil降低幅度與基線比值在≤46%組和>46%組間差異有統計學意義(P=0.021)；10 d時，PTA上升幅度與基線比值在≤46%組和>46%組間差異差異有統計學意義(P=0.048)(圖5)。

3 討論

HBV感染占我國ACLF病因80%以上，HBV-ACLF病死率高達62.18%～72.3%[4]。鑒于供體來源和經濟條件的限制，能行肝移植術者有限，內科和人工肝綜合支持治療仍然是治療肝衰竭的主要手段[5]。GC治療HBV-ACLF仍有爭論，但鑒于近年來對GC不良反應及并發癥防治手段的增強，核苷類似物等病因治療的加強，部分醫生認為GC可通過抑制細胞毒性T淋巴細胞等淋巴細胞的免疫應答，調節Th1/Th2、Th17/Treg比例來發揮免疫抑制作用，延緩或阻止過強的細胞免疫所致的組織損傷[6]，同時能抑制多種促炎細胞因子如TNFα、IFNγ、IL-1和IL-6產生和釋放，增強抑炎因子IL-10的產生與釋放[7-8]，補充不足的皮質醇，延緩或阻止繼發性的炎癥反應發生，提高機體應激耐受能力，為肝細胞再生提供有利條件。因此，GC可作為治療肝衰竭的一種治療選擇方法。

臨床治療中發現機體對GC反應存在個體差異，除目前大多認為GC療效可能與治療人群的選擇及開始用GC治療的時機有關外，考慮與個體GC敏感性相關。GC與GR結合后才能發揮其生物學效應。GR亞型被認為與GC敏感性密切相關，研究[9]發現GR數量及其亞型表達的差異可能影響GC效應。GR主要有GR-α、GR-β兩種形式，GR-α占主導地位，是介導GC發揮生物學作用的主要受體。多數研究認為，GC抵抗的發生可能是由于GR-α表達水平下降所引起，如Liang等[10]報道在原發免疫性血小板減少癥患者中GR-α表達水平下降與激素抵抗密切相關。而GR-β表達水平極低，不與GC結合，對GC的療效起負性調節作用，干擾GR-α的功能[10]，并可通過干擾GR-α與轉錄因子NF-κB和AP-1結合阻礙其發揮作用[11]。但也有部分學者持相反觀點，Jakiea等[12]對40例哮喘患者的研究未發現GC抵抗與GR-α、GR-β mRNA及GR-β/GR-α有關。目前國內外對于HBV相關肝衰竭GR及其亞型研究較少，Gao等[13]報道HBV-ACLF患者外周血單個核細胞(PBMC)中GR-α mRNA表達水平顯著低于正常人，而GR-β mRNA表達水平顯著高于正常人和慢性乙型肝炎患者。激素受體亞型動態變化是否對激素療效具有預測作用？本研究發現HBV-ACLF短療程甲強龍治療HBV-ACLF患者2周內在改善TBil和PTA指標方面明顯優于非激素組。激素敏感組TBil與PTA 10 d、14 d和28 d指標改善明顯優于激素不敏感組，激素敏感組GR-α mRNA 8 d降低幅度明顯小于激素不敏感組，提示應用GC后GR-α mRNA表達水平較基線降低。以GR-α mRNA表達降低幅度占基線百分比均值為界線，GR-α mRNA較基線降低幅越小，對激素敏感。應用GC后GR-α mRNA表達降低與Urzua等[14]報道應用GC治療Vogt-小柳-原田病后GR-α mRNA表達上升不一致，但激素敏感者GR-α mRNA的表達高于激素不敏感者的結論是一致的。分析原因可能為：(1)本研究患者均為HBV-ACLF患者，疾病人群不同，免疫功能等基礎不同；(2)推測GR-α mRNA較基線降低，可能是GC進入細胞膜與有效受體結合后在核定位序列的介導下轉入核內發揮生物學效應，消耗了一定數量的GR-α，但同時應用激素反應好的患者可能刺激機體產生較多的GR-α；(3)本研究樣本量偏少，應擴大樣本量進一步研究激素受體動態變化的趨勢及機制。

GR-β可能作為一種潛在的內源性GC效應的拮抗因子，其含量僅占GR-α的0.2%～0.3%，本組資料應用激素后GR-β表達變化趨勢與GR-α一致，對激素療效結果影響較小。本研究發現HBV-ACLF早、中期患者使用糖皮質激素后GR-α mRNA表達水平明顯降低，激素敏感組患者GR-α mRNA水平較基線降低幅度小，有利于肝功能改善，這對于判斷患者使用激素的療效具有一定指導意義，為遠期是否選擇進行移植術提供一定理論依據。激素與受體結合發揮生物學效應遠不止與激素受體亞型表達有關，是一個極其復雜龐大的通路在發揮作用，任何處于通路中的相關因素都可能影響激素的療效，應深入對此通路進一步研究。