藍(lán)莓花青素對(duì)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖、侵襲的影響及機(jī)制研究

艾福錄 呂武 趙國華

摘要 目的：探討藍(lán)莓花青素（BA）對(duì)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。方法：低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞分別以25、50、100 μg/mL BA與等量生理鹽水處理，分別處理12 h、24 h、48 h。采用噻唑藍(lán)（MTT）與流式細(xì)胞儀檢測人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖與凋亡;采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)與免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測人胃腺癌BGC-823細(xì)胞侵襲與P53、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)。結(jié)果：干預(yù)48 h時(shí)，對(duì)照組、低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞P53與Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞百分比分別為（11.12±1.01）%，（24.31±2.18）%，（47.56±2.91）%，（66.49±5.14）%與（15.04±1.23）%，（28.22±3.09）%，（69.36±5.42）%，（86.52±6.15）%。實(shí)驗(yàn)組胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖抑制率隨BA濃度增大而逐漸升高;與對(duì)照組比較，低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞凋亡率、P53與Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞百分比均顯著升高，侵襲率降低，呈濃度依賴性（均P<0.05）。結(jié)論：BA可有效抑制胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并降低侵襲能力，其機(jī)制可能與上調(diào)P53與Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 胃腺癌;藍(lán)莓花青素;增殖;侵襲;P53;半胱氨酸蛋白酶-3

Abstract Objective：To investigate the effects and related mechanism of blueberry anthocyanins （BA） on the proliferation and invasion of human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells.Methods：Human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells exp-L/M/H and the control group were treated with BA at the concentration of 25，50，100 μg/mL and the same amount of normal saline respectively，and each group was treated for 12，24，and 48 hours.The proliferation and apoptosis of human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells was detected by MTT assay and Flow cytometry; Transwell chamber assay and immunocytochemistry method were used to detect the invasion of human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells and the expression of P53 and caspase-3 protein.Results：At 48 h after intervention，the percentage of P53 cells and Caspase-3 protein positive cells in human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells in the exp-L/M/H were （11.12±1.01）%，（24.31±2.18）%，（47.56±2.91）%，（66.49±5.14）% and （15.04±1.23）%，（28.22±3.09）%，（69.36±5.42）%，and （86.52±6.15）%，respectively.With the increase of BA concentration，the proliferation inhibition rate of gastric adenocarcinoma BGC-823 cells in experimental group increased gradually; Compared with the control group，the apoptotic rate，P53 protein and Caspase-3 protein positive percentage of human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells in the exp-L/M/H groups significantly increased，while the invasive rate decreased and the trend was concentration-dependent （all P<0.05）.Conclusion：BA can effectively inhibit the proliferation of gastric adenocarcinoma BGC-823 cells，induce its apoptosis，and reduce its invasive ability，which may be related to the up-regulation of P53 protein and Caspase-3 protein expression.

Keywords Gastric adenocarcinoma; Blueberry anthocyanins; Proliferation; Invasion; P53; Cysteine protease-3

胃癌是較為常見的惡性腫瘤，具有高度異質(zhì)性，侵襲和轉(zhuǎn)移力極強(qiáng)[1]。已有研究證實(shí)，花青素可抑制肺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲[2]。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓花青素（BA）可通過線粒體凋亡途徑對(duì)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞具有生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，BA可通過下調(diào)P53基因DNA甲基化抑制口腔癌KB細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡[4]。目前，關(guān)于BA在胃腺癌細(xì)胞方面的相關(guān)研究報(bào)道較少，因此本研究旨在探討B(tài)A對(duì)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖、侵襲能力及P53、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達(dá)的影響，為臨床治療胃腺癌尋找高效、低毒的干預(yù)新手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人胃腺癌BGC-823細(xì)胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所細(xì)胞庫。用含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。

1.1.2 藥物 藍(lán)莓花青素（河南華馳生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20190820），純度90%。

1.1.3 試劑與儀器 噻唑藍(lán)（MTT）（美國Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：H17088）;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，生產(chǎn)批號(hào)：M170312）;Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：K180408）;Matrigel膠（美國BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：M180409）;鼠抗人P53、Caspase-3多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，生產(chǎn)批號(hào)：M180207）;免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：K180801）等。二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Thermo scientific公司，型號(hào)：KSD-1211）;超凈工作臺(tái)（蘇州長留凈化科技有限公司，型號(hào)：SKS-1102）;Transwell小室（美國Millipore公司，型號(hào)：MSG-1277）;光學(xué)倒置顯微鏡（日本Olympus公司，型號(hào)：XSK1100）;C6 Flow Cytometer流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號(hào)：DKD-8700）等。

1.2 方法

1.2.1 人胃腺癌BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)[5]、分組及處理 用含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。取對(duì)數(shù)期人胃腺癌BGC-823細(xì)胞，接種于96孔板中。低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別以25、50、100 μg/mL BA、等量生理鹽水處理，各組分別干預(yù)12、24、48 h。

1.2.2 MTT法[6]檢測人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖情況 細(xì)胞分組及處理同1.2.1，分別于干預(yù)12、24、48 h后，每孔加MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，孵育4 h。于570 nm處檢測各孔光密度（OD）值，計(jì)算人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD570 nm/對(duì)照組OD570 nm）×100%。并設(shè)置8復(fù)孔對(duì)照，且各組均重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀[7]檢測人胃腺癌BGC-823細(xì)胞凋亡率 人胃腺癌BGC-823細(xì)胞調(diào)整密度為5×104個(gè)/mL，接種于24孔板，細(xì)胞處理及分組同1.2.1，并設(shè)置6復(fù)孔，且各組均重復(fù)3次。分別于孵育12 h、24 h、48 h后，按試劑盒說明書收集細(xì)胞，洗滌，重懸于Binding buffer，加入AnnexinV/FITC（5 μL）和碘化丙錠（PI）染色液（10 μL），避光處反應(yīng)10 min，采用流式細(xì)胞儀BD FACSuite軟件作圖，統(tǒng)計(jì)Q2與Q3區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)目，細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)Q2+Q3/細(xì)胞總數(shù)Q2+Q3×100%。

1.2.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)[8]檢測人胃腺癌BGC-823細(xì)胞侵襲能力 將人工基質(zhì)膠50 μL分別涂于Transwell插入式的培養(yǎng)皿濾膜的24孔表面，孵育6 h，形成凝膠狀物質(zhì)。收集對(duì)數(shù)期、用無血清DMEM處理的人胃腺癌BGC-823細(xì)胞，細(xì)胞分組及處理同1.2.1;下室加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，500 μL/室，48 h后，甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色。將以上各小室內(nèi)表面沒有穿透濾膜的細(xì)胞均擦掉，于光學(xué)倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)量。侵襲率=下室細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)量×100%。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法[9]檢測人胃腺癌BGC-823細(xì)胞P53、Caspase-3蛋白表達(dá) 滅菌的蓋玻片吸附于24孔板，取對(duì)數(shù)生長期胃腺癌BGC-823細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個(gè)/mL，接種于24孔板，細(xì)胞分組及處理同1.2.1，設(shè)正常和陰性對(duì)照組。24 h后取出蓋玻片，PBS清洗，丙酮固定，過氧化酶阻斷劑30 min，與一抗（P53、Caspase-3抗體，1∶500）和二抗（1∶500）結(jié)合，顯色，蘇木精復(fù)染，封片。每張玻片于光學(xué)顯微鏡下（×400）隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，同時(shí)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，以胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色為陽性。陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，符合正態(tài)分布時(shí)，2組之間比較采用Dunnett′s t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖抑制情況 干預(yù)48 h時(shí)，低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖抑制率分別為（12.64±1.37）%，（41.86±2.14）%和（76.16±3.99）%。干預(yù)12～48 h，胃腺癌BGC-823細(xì)胞隨干預(yù)時(shí)間延長與劑量增大，增殖抑制率逐漸增加（P<0.05）。見表1。

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞凋亡率比較 干預(yù)48 h時(shí)，對(duì)照組、低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞凋亡率分別（4.97±1.54）%，（17.23±2.98）%，（37.24±4.67）%，（71.03±5.88）%。干預(yù)12～48 h，各組凋亡率隨干預(yù)時(shí)間延長而逐漸升高;實(shí)驗(yàn)組凋亡率均較對(duì)照組顯著升高，且隨著BA劑量增大，凋亡率逐漸升高（P<0.05）。見表2。

2.3 各組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞侵襲力比較 干預(yù)48 h時(shí)，對(duì)照組、低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞侵襲率分別為（94.12±2.78）%、（71.35±2.23）%、（49.53±1.89）%、（31.68±1.47）%。與對(duì)照組比較，不同劑量實(shí)驗(yàn)組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞侵襲率均顯著降低，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.4 各組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞P53、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組胃腺癌BGC-823細(xì)胞的胞質(zhì)幾乎不著色;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)淡黃色至棕黃色，且隨著BA濃度的增加，顏色逐漸加深。見圖2。干預(yù)48 h時(shí)，對(duì)照組、低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞P53蛋白陽性細(xì)胞百分比分別為（11.12±1.01）%，（24.31±2.18）%，（47.56±2.91）%，（66.49±5.14）%;Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞百分比分別為（15.04±1.23）%，（28.22±3.09）%，（69.36±5.42）%，（86.52±6.15）%。與對(duì)照組比較，不同劑量實(shí)驗(yàn)組P53蛋白及Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞百分比均顯著升高，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

花青素廣泛存在于多種水果和蔬菜中，其中屬藍(lán)莓中的花青素含量最高。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓因含有花青素具有抗炎、抗氧化、抗癌及調(diào)節(jié)免疫等多種功效[10]。研究顯示，BA可抑制結(jié)腸癌ls174t細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，降低侵襲力，機(jī)制可能與上調(diào)P53蛋白表達(dá)和下調(diào)半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）蛋白表達(dá)有關(guān)[11]。有研究表明，BA對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞活力有明顯的抑制作用，并可抑制其增殖，影響細(xì)胞周期[12]。也有研究表明，BA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有抑制增殖作用，其機(jī)制可能與增加組蛋白乙酰化修飾，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖抑制率隨BA濃度增大而逐漸升高;且與對(duì)照組比較，低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組人胃腺癌BGC-823細(xì)胞凋亡率顯著升高，而侵襲率降低，提示BA可有效抑制人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并降低侵襲能力。

在誘導(dǎo)凋亡的各種通路中，P53介導(dǎo)的凋亡通路在維持細(xì)胞穩(wěn)定中起重要作用;Caspase-3是Caspase家族的關(guān)鍵酶，是凋亡過程中的效應(yīng)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，BA可誘導(dǎo)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡，其機(jī)制可能與P53基因mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)，BA可以劑量依賴的方式抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，且BA處理組中Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著增加[15]。本研究結(jié)果顯示，低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組P53蛋白及Caspase-3蛋白的陽性細(xì)胞百分比均顯著顯著高于對(duì)照組，且呈濃度依賴性，表明BA可上調(diào)P53蛋白及Caspase-3蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞凋亡。

綜上所述，BA可顯著抑制人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖、侵襲能力，誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)上調(diào)P53蛋白及Caspase-3蛋白表達(dá)水平，發(fā)揮抗腫瘤作用，為BA的推廣使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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