揭秘!核酸檢測大法是如何進行的

南枝

2019年12月以來，我國湖北省武漢市陸續發現多例新型冠狀病毒性肺炎患者，隨著疫情蔓延，我國其他地區及境外也相繼發現了這一類病例。該病為急性呼吸道傳染病，已納入《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病。

新型冠狀病毒性肺炎診療方案里，對新型冠狀病毒性肺炎的病原學確診，需要具備病原學證據。

對病原學證據的確定，主要包括兩個方法，一是通過實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性，二是病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。國內主要使用的是第一種，通過實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸，這一方法不僅快速而且準確率高。

那么，通過實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒，原理到底是什么，具體又是怎么操作的呢？

新型冠狀病毒病原學特點

冠狀病毒為單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronavirdae）正冠狀病毒亞科（Orthocoronavirinae），分為α、β、γ和δ四個屬。

2019新型冠狀病毒（2019 Novel Coronavirus，2019-nCoV）正好屬于冠狀病毒的β屬，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60-140nm。其基因特征與SARS-CoY和MERS-CoV有明顯區別。目前，研究顯示與蝙蝠SARS樣冠狀病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性達85%以上。

病毒，是自然界最簡單的生命形式。它的組成成分非常簡單，最基本的構成是遺傳物質（DNA或者RNA）和蛋白質，有時也會存在糖類與脂質組成的包膜。每種生物的遺傳物質都有和其他物種不一樣的地方，這是鑒定一種物種最準確的方法。

新冠病毒的遺傳物質為RNA，它的RNA中的特異性序列可以用于區分該病毒與包括其他病原在內的物種。這是通過檢測核酸序列來檢測新冠病毒的基礎。

鑒定的主要方法是完成對新型冠狀病毒全基因組測序，并將其基因組序列與其他物種的基因組序列進行比對，找到新冠病毒中的特異核酸序列。這些特異核酸序列是新冠病毒必須含有，又和其他物種存在不一樣的部分。只要找到它們，就可以證明存在新冠病毒，且只是新冠病毒，而不是其他的東西。

現如今，使用的新冠病毒的特異性序列便包括新冠病毒基因組中的ORF1ab、N、S、E區。國內檢測新冠病毒用得最多的則是ORF1ab和N區。

如何檢測新冠病毒的特異性序列

我們通過研究找到了新冠病毒的特異性序列，那要怎么將它們從患者的樣本里檢測出來呢？

主要步驟包括：

1.獲得患者的樣本（咽拭子、鼻拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、糞便、肛拭子等）

2.從患者的樣本中提取病毒RNA

3.將病毒RNA進行熒光定量PCR

原理是以新冠病毒特異性的基因序列為檢測靶標，通過PCR擴增，使我們選擇的這段靶標DNA序列指數級增加，每一個擴增出來的DNA序列，都可以和我們預先加入的一段特定的熒光標記探針結合，產生熒光信號。擴增出來的靶基因越多，累積的熒光信號就越強，通過監測熒光信號可以確定樣本中是否有病毒核酸。

經過以上熒光定量PCR后，在實驗室要確認一個病例為新冠病毒陽性，需要滿足以下條件：同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。如果出現單個靶標陽性的檢測結果，則需要重新采樣，重新檢測。這用于保證結果的準確性。

至此，新型冠狀病毒核酸檢測全過程就完成了。

PCP（Polymerase Chain Reaction.聚合酶鏈式反應）是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術。通過將特定模板雙鏈DNA要性解鏈成單鏈，再將擴增物和模板DNA互補結合，再在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按照堿基互補配對原則，進行半保留復制，合成一條新的DNA。新的DNA再變性解鏈成單鏈，如此，進行循環，每個循環大約用1-3分鐘，這樣，在短短1-2個小的內就能將目的基因擴增放大幾百萬倍。

因PCR的反應模板只能是DNA，而新冠病毒核酸是單鏈RNA，所以，在PCR之前，需要先將新冠病毒核酸（單鏈RNA）逆轉錄為DNA，再進行PCR。

熒光定量PCR，則是在PCR反應體系中，在包含一對特異性引物外，還有一個Tagman探針，該探針為一段PCR擴增序列中的特異陸寡核苷酸序列，它的兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，不發光;如反應體系存在靶序列，PCR反應時探針與模板結合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團分離，便會發出熒光。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產生。熒光定量PCR儀能夠監測熒光信號以及熒光到達預先設定閾值的循環數（Ct值）。該循環數（Ct值）與病毒核酸濃度有關，病毒核酸濃度越高，循環數（Ct值）值越小。不同生產企業的產品會依據自身產品的性能確定本產品的循環數（Ct值）陽性判斷值。