豬肉新鮮度指示標簽的制備及應用

杜月紅　王琳　高曉光　孫志偉　白瑩瑩　趙熙

摘 要：基于豬肉在腐敗過程中產生的揮發性含氮化合物會使包裝中氣體酸堿性發生變化的原理，以甲基纖維素和聚乙二醇-6000為基材，添加溴甲酚紫、溴百里酚藍等酸堿指示劑，最終制得6 種方便、無損的新鮮度指示標簽。將標簽置于不同質量濃度的NH3環境中，6 種標簽的顏色均發生顯著變化，且隨NH3質量濃度的增加而差異變化明顯;將標簽應用于生鮮豬肉貯存中，通過測定4 ℃條件下不同貯存時間豬肉各項腐敗指標以及指示標簽的顏色變化，探究其用于監測生鮮豬肉新鮮度的可行性。結果表明：初始pH值為4.24的溴甲酚紫指示標簽可較好地區分出豬肉的3 個新鮮度等級;利用此標簽的顏色測定數據建立偏最小二乘模型，對揮發性鹽基氮含量和菌落總數進行預測的回歸系數（R2）均大于0.92，通過標簽顏色變化可以判斷豬肉新鮮度。

關鍵詞：新鮮度指示標簽;瘦豬肉;總揮發性鹽基氮

Abstract： Methylcellulose and polyethylene glycol-6000 were used as film-forming substrates， and synthetic dyes were added to prepare six easy-to-use indicator labels （FIL） for pork freshness assessment based on the fact that the color of indicator labels will change when absorbing the volatile ammonia released from pork during spoilage. When used for the detection of NH3， all color labels exhibited significant color changes showing obvious differences with the increase of gas concentration. To explore their feasibility for evaluating the freshness of pork stored at 4 ℃， the color changes of these labels were recorded and various spoilage indicators were measured at different storage times. The results also showed that the FIL made with bromocresol purple （at an initial pH of 4.24） was able to discriminate freshness， medium freshness， and spoilage. The statistical models obtained by partial least squares based on the color changes of labels 3 and 4 successfully predicted total volatile basic nitrogen （TVB-N） contents and aerobic plate counts （APC） of pork with regression coefficients （R2） greater than 0.92. Accordingly， pork freshness could be judged by the color changes of the labels.

Keywords： freshness indicator label; lean pork; total volatile basic nitrogen

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191204-296

中圖分類號：TS206.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）05-0041-07

隨著居民生活水平的提高，消費者的食品安全意識和健康觀念逐漸提升，因此對食品質量安全和營養衛生也提出了更高要求。豬肉在我國居民肉類食品中消費量最高，2016年我國豬肉產量為肉類總產量的62%[1]。然而，生鮮豬肉極易發生變質腐爛現象，造成嚴重經濟損失。因此，在豬肉的貯藏、運輸和銷售環節中，實時監測豬肉的新鮮度十分必要。

傳統的肉類新鮮度評價方法包括理化分析、微生物數量檢測和感官評定等方法。揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量與豬肉新鮮度相關性最高，是目前肉品新鮮度檢測中的重要理化指標[2-3]。但是上述方法存在操作復雜、費時耗力、對實驗人員技術要求較高等局限。新興的檢測方法，如紅外光譜、超聲波、核磁共振技術和電子鼻等需要借助儀器，成本較高，且不適用于密封包裝產品的檢測[4-5]。因此，探索微型、簡單、方便快捷的豬肉新鮮度無損檢測方法具有重要意義，同時為消費者選擇肉制品提供可靠依據。

新鮮度指示標簽是一種可實時監測食品品質變化的技術，國內外學者在提高指示標簽的應用方面擁有眾多研究，并已經取得了一定進展。許多國外企業與學者嘗試將其應用于魚類、牛肉和水果等不同食品中。例如負載溴甲酚綠（pH 4.72）的標簽可實時監測包裝內鱈魚魚頭的TVB-N含量，根據標簽的顏色變化可以準確判斷魚類的新鮮度[6]。Kuswandi等[7]基于甲基紅和溴甲酚紫構建了雙傳感器標簽用于監測牛肉新鮮度，該標簽可以清晰、容易地檢測到牛肉的腐敗，并準確反映牛肉的新鮮度，其中甲基紅標簽由紅色變為黃色，而溴甲酚紫標簽由黃色變為紫色。Aranya等[8]以淀粉為主要原料，通過添加殼聚糖、甲基紅和溴百里酚藍制備一種新型指示標簽，其物理性能良好，適用于新鮮榴蓮中硫化合物的檢測。國內新鮮度指示標簽的發展較為緩慢，尚處于起步階段。朱惠綿等[9]通過在指示卡基材中添加復合酸堿指示劑、緩沖溶液等成分，研制出一種能通過顏色變化直接反映食品包裝環境中CO2體積分數的指示卡，當包裝環境中的CO2超過一定體積后，該指示卡在60 min內即可作出響應并及時指示包裝食品的質量。鄒小波等[10]以玫瑰茄花青素提取物制備可檢測肉類新鮮度的智能指示膜，并比較分析不同基材復合膜在機械性能、水溶性、微觀結構以及顏色穩定性等方面的差異。然而這些研究仍處于實驗室研究階段，尚未能廣泛應用。

新鮮度指示標簽的構建（如包裝中揮發性氣體與指示劑的選擇）是新鮮度指示標簽有效監測食品品質的關鍵因素。生鮮豬肉變質速率較快，因此需要響應更為及時的標簽指示體系，而目前研究的指示標簽的響應速率較慢、靈敏度較低[11]，并且較難區分食品新鮮等級，因此，新鮮度指示標簽的構建及響應仍需進一步深入研究。本研究以甲基纖維素和聚乙二醇-6000為基材，通過添加溴甲酚紫、溴百里酚藍等酸堿指示劑溶液制得新鮮度指示標簽，檢測其在不同質量濃度NH3環境中的顯色情況，并設計一種非接觸式包裝，以期有效避免指示標簽對豬肉樣品的污染，考察其用于實時監測瘦豬肉新鮮度的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮去皮豬精瘦肉 河北省石家莊市北國超市。

聚乙二醇-6000 天津市科密歐化學試劑有限公司;甲基纖維素、甲基紅指示劑、溴甲酚紫指示劑 阿拉丁試劑（上海）有限公司;溴百里酚藍指示劑 天津市鼎盛鑫化工有限公司;食品級聚乙烯（水蒸氣透過率為150 g/（m2·d））保鮮膜 無錫市優能塑業有限公司。

1.2 儀器與設備

CR-400色彩色差計 日本柯尼卡美能達控股公司;ST2100實驗室pH計 奧豪斯儀器（常州）有限公司;SX500高壓滅菌鍋 日本Tomy公司;101-2A型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指示標簽的制備

制備方法參照文獻[10，12]。配制溴甲酚紫、溴百里酚藍染料指示劑（5 g/L）和溴百里酚藍與甲基紅（質量比3∶2）混合指示劑（5 g/L），將30 g/L甲基纖維素和10 g/L聚乙二醇-6000在蒸餾水中溶解并混合均勻，靜置24 h去除氣泡，按40 mL/L分別加入各染料并攪拌均勻，調節pH值（表1），倒入玻璃平皿，40 ℃熱風干燥8 h去除溶劑，揭下指示膜并將其剪成1.2 cm×1.2 cm大小，以1.5 cm×1.5 cm濾紙為背景制備6 種指示標簽，將其排列分布于密封盒蓋表面，用聚乙烯保鮮膜覆蓋標簽和濾紙，密封，以避免指示標簽與豬肉樣品的接觸。

1.3.2 指示標簽對不同質量濃度NH3的顯色靈敏度測試

利用濃氨水的易揮發性質釋放NH3，使密封盒內NH3達到不同質量濃度（1、3、5、10、20、30 μg/mL）。在恒定照明條件下，利用色差儀根據CIE-L*a*b*顏色系統，以蒸餾水空白樣品為色差參比，測定指示標簽的顏色指標[11]。L*為明亮度，a*為紅綠度，b*為黃藍度。按照下式計算總色差值（ΔE）。

式中：ΔL*=L*-L0*、Δa*=a*-a0*、Δb*=b*-b0*;L*、a*、b*為樣品密封盒標簽的測定值;L0*、a0*、b0*為蒸餾水空白樣品密封盒標簽的測定值。

1.3.3 指示標簽對豬肉新鮮度的檢測

1.3.3.1 樣品處理

將新鮮精瘦豬肉于無菌環境下切分成每塊（150±10）g，放入密封盒，對照組密封盒中加入（150±10）g蒸餾水，用粘貼好6 種標簽的蓋子密封，置于4 ℃生化培養箱中貯存16 d。實驗組分為2 部分，第1部分包括3 組平行樣品，用于每天測定標簽和肉樣的?E值，并進行感官評價;第2部分包括17 組樣品，每天取1 組樣品檢測豬肉腐敗相關指標（包括TVB-N含量、菌落總數、pH值和持水性）。

1.3.3.2 指標測定

按1.3.2節方法測定對照組和3 個樣品組中每個標簽和精瘦豬肉的顏色變化并計算ΔE。TVB-N含量：參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》中的自動凱氏定氮儀法[13]。菌落總數：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》[14]。pH值：稱取10 g樣品切碎，加入盛有90 g蒸餾水的絞肉機中，破碎勻漿2 min，用pH計測定。持水力參照文獻[12]的方法。

1.3.3.3 感官評價

根據表2感官評分標準，對樣品氣味、黏度、色澤、組織狀態4 個感官特性進行評價，對每個特性細化分級，組織9 名經過感官評價訓練的人員進行評分，分別計算總分并取平均值，結果7 分以上為良好品質，5 分是可接受限度[15-16]。

1.4 數據處理

所有實驗均重復測定3 次，結果以平均值±標準差表示。用SPSS 16.0軟件處理指標測定數據。使用一般線性模型程序進行單因素方差分析，比較5%顯著水平的平均值。用主成分分析評估指示標簽的可行性。用Origin Pro 9.0軟件進行偏最小二乘回歸分析，根據指示標簽獲得的數據預測TVB-N含量和菌落總數。

2 結果與分析

2.1 指示標簽對于不同質量濃度NH3的顯色結果

由圖1可知：6 種指示標簽在不同質量濃度NH3環境中均發生不同顏色變化，這是因為濃氨水揮發釋放NH3，導致密閉環境中堿性氣體質量濃度增加，指示標簽的顏色也隨之發生變化;標簽1、2、5表現為黃-綠-藍的變色趨勢，標簽4僅觀測到由黃色變為藍色，標簽3由最初的紅色變為黃色，最終變為藍色和綠色，標簽6變色較為緩慢，由紅色逐漸變為綠色。以上結果表明，指示標簽的靈敏度差異與指示劑種類和成膜基質的初始pH值相關。

由圖2可知，隨著環境中NH3質量濃度的增加，指示標簽顏色變化越來越明顯，此結果與陳慧芝[17]的研究結果一致。在NH3質量濃度為1 μg/mL時，標簽4 ΔE明顯增大，達到50.87，但NH3質量濃度進一步增大，標簽4 ΔE無明顯變化，這也解釋了標簽4只有2 種顯色的原因。對于不同NH3質量濃度，6 種標簽顏色均發生明顯變化，說明用指示標簽的顏色變化來實時監測冷鮮肉密封包裝中堿性氣體含量具有潛在可行性。Dilidaer等[18]對用于監測包裝火腿新鮮度的酚紅標簽進行評價，結果表明該標簽可以對CO2氣體含量迅速作出變色反應，且實用性較好。由于豬肉腐敗過程中也會產生CO2等其他氣體，所以指示標簽對于其他氣體的響應靈敏度也值得進一步探究。

2.2 貯存期間豬肉品質的變化

2.2.1 貯存期間豬肉顏色的變化

由圖3可知，在4 ℃貯存條件下，隨著貯存時間延長，豬肉ΔE不斷增加，表明豬肉顏色發生變化。這是由于豬肉中肌紅蛋白被氧化成氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白，顏色由鮮紅色變為紅褐色或紫紅色[19]。ΔE>12時，表示不同的顏色空間，即可以通過肉眼很容易觀察到顏色變化[20]。貯存16 d時，豬肉呈暗紅色，ΔE<12，但已產生非常明顯的腐臭味，且幾乎完全失去彈性，這說明消費者無法憑借肉眼觀察直觀地判斷豬肉的新鮮度。

2.2.2 貯存期間豬肉TVB-N含量的變化

TVB-N含量是評價豬肉新鮮度的重要參考指標[21]。新鮮肉TVB-N含量≤10 mg/100 g，次級鮮肉TVB-N含量10～15 mg/100 g，腐敗肉TVB-N含量達到15 mg/100 g以上[22]。由圖4可知：豬肉TVB-N含量在貯存0～6 d時低于10 mg/100 g，表明樣品為新鮮級別;貯存7～10 d時，TVB-N含量為10～15 mg/100 g，此時豬肉已有輕微異味，為中等新鮮度。貯存11 d豬肉樣品腐敗變化明顯，已有嚴重的腐臭氣味，TVB-N含量達到（16.51±0.51）mg/100 g。劉飛等[23]采用近紅外光譜有效變量快速檢測豬肉TVB-N含量的測定結果與本實驗結果相似。豬肉在貯存期間發生腐敗變質，主要是因為微生物污染產生的代謝物（如胺、醛、酮和酯類）以及其他生化反應產生異味和感官排斥的低分子質量物質。

2.2.3 貯存期間豬肉菌落總數的變化

根據GB/T 9959.2—2008《分割鮮、凍豬瘦肉》，新鮮肉類的微生物數量≤106 CFU/g[24]。由圖5可知，貯存期間豬肉菌落總數逐漸增加，貯存10 d時，菌落總數超過限值，與TVB-N含量達到可接受限值的時間一致。肉類營養豐富，可以滿足多種腐敗菌和病原菌的生長需求，是理想的天然微生物培養基，因此新鮮豬肉極易遭到微生物污染[25]。

2.2.4 貯存期間豬肉pH值的變化

由圖6可知，貯存前期豬肉pH值呈波動變化，貯存7 d時pH值為6.40±0.05，貯存16 d時，豬肉pH值為7.00±0.12;pH值變化趨勢與廖宜濤等[26]的研究結果基本一致。貯存前期豬肉pH值出現波動，可能是由于肌肉中肌糖原分解產生的乳酸和磷酸等酸性物質中和了豬肉表面細菌生長代謝產生的堿性物質。由于pH值增加更有利于微生物的生長，因此貯存后期豬肉變質更加明顯。

2.2.5 貯存期間豬肉持水力的變化

由圖7可知，貯存期間豬肉持水力總體呈下降趨勢，由最初的85.33%降低到68.67%。豬肉持水性是指在冷凍、冷藏、絞碎等加工處理過程中，豬肉維持自身水分及吸收外部添加水分的能力。持水性是衡量豬肉品質和營養價值的重要指標，與豬肉的嫩度、彈性、口感、質地等品質具有直接聯系[27]。研究發現，隨著肌肉中蛋白質含量的減少，其持水力和結合水含量也隨之降低[28]。李俠等[29]研究發現，隨著貯存時間的延長，豬肉中肌原纖維蛋白不斷氧化以及肌原纖維骨架被破壞，肉的持水性變差。

2.2.6 貯存期間豬肉感官品質的變化

豬肉的感官品質包括顏色、氣味、表面黏性、彈性和嫩度等，直接反映了豬肉的新鮮度。由圖8可知：豬肉感官評分在貯存過程中逐漸下降;貯存7 d時，感官評分低于7 分（良好品質），貯存10 d時，感官評分低于5 分，低于可接受限度，與TVB-N含量達到可接受限值的時間基本一致。貯存11 d時樣品出現滲液和難以接受的腐敗異味。

綜上所述，貯存11 d時豬肉TVB-N含量、菌落總數和感官評分均超過可接受限值[30]，因此，確定豬肉腐敗臨界時間點為貯存11 d;確定貯存0～6 d為新鮮期，貯存7～10 d為中等新鮮期，貯存11～16 d為腐敗期。

2.3 指示標簽在豬肉貯期間的顯色情況

2.3.1 指示標簽顏色和ΔE變化情況

由圖9可知：隨著貯存時間的延長，豬肉的顏色變深，新鮮度降低，同時，指示標簽的顏色也發生不同程度的變化。豬肉變質時會釋放揮發性有機堿，導致密封包裝環境中堿性氣體成分增加。同時，密封包裝中樣品水分揮發，滲入指示膜中成為指示劑。因此，隨著包裝頂部空間中堿性腐敗揮發性氣體逐漸增加，指示標簽的顏色隨pH值的增加而變化，從而顯示出肉類的腐敗情況。Huang Shaoyun等[31]用紫草提取的天然染料和瓊脂制備一種用于檢測魚類新鮮度的指示標簽，結果表明，新鮮度標簽的顏色響應與魚肉樣品中TVB-N含量的變化相關。因此，指示標簽可以通過肉眼可見的顏色變化來指示豬肉的腐敗情況。

A～F. 貯存時間分別為1、3、7、9、11、16 d。

圖10顯示了6 種指示標簽在4 ℃條件下貯存不同時間的顏色變化。指示標簽4、5、6的顏色變化分別與指示標簽1、2、3相似。根據上述腐敗指標檢測結果，豬肉品質可以分為新鮮（貯存0～6 d）、中等新鮮（貯存7～10 d）和腐敗變質（貯存11～16 d），指示標簽4的顏色在這3 個階段均有明顯變化，0～6 d為金色，7～10 d為棕黃色，11～16 d為藍色，但在同一階段內變化不明顯，因此能較好地指示豬肉的新鮮程度。標簽3在豬肉貯存期間顏色也呈顯著變化，0～7 d呈現紅色，8 d時顏色逐漸變為黃色，11 d時變為綠色，與豬肉新鮮度變化結果基本一致。其他標簽不能提供豬肉腐敗的可靠信息，例如：標簽1在貯存0～9 d的顏色變化不明顯;標簽2顏色在貯存12 d時才發生變化，而此時豬肉已腐敗變質;標簽5和標簽6也同樣存在顏色變化遲緩的問題，無法有效區分豬肉的新鮮期和中等新鮮期。Liu等[32]用溴甲酚綠制備傳感標簽用于監測和評估魚的新鮮度，觀察到傳感標簽出現黃-綠-深藍的顏色變化，說明此類新鮮度指示標簽對于魚類的新鮮度檢測具有實際意義。根據其顯色原理，該標簽也可應用于牛羊肉等其他肉類產品的檢測實踐中。

由圖11可知，新鮮期（貯存0～6 d）所有指示標簽ΔE均相對較低。與其他標簽相比，標簽4在貯存7 d時ΔE超過12，說明顏色變化顯著，而在腐敗期（貯存11～16 d）ΔE達到40。因此，指示標簽4最適合用于區分豬肉新鮮期、中等新鮮期和腐敗期。

2.4 指示標簽顏色變化的主成分分析和偏最小二乘分析結果

A. 指示標簽3;B. 指示標簽4。

對不同指示標簽的顏色信息進行主成分分析，由圖12可知，指示標簽3的顏色信息不能區分新鮮期和中等新鮮期豬肉樣品，指示標簽4的顏色信息能較好地區分新鮮期（貯存0～6 d）、中等新鮮期（貯存7～10 d）、腐敗期（貯存11～16 d）豬肉樣品;主成分1和主成分2的總貢獻率為91.55%，表明該結果能較好地反映原始數據集信息。因此，指示標簽4的顏色變化與豬肉樣品在4 ℃冷藏條件下新鮮度變化的相關性最佳，且肉眼易察覺，這一結果與Chun等[33]研究結果相似。

偏最小二乘法是一種多元投影法，可用于分析指示標簽4的顏色測定數據以預測包裝豬肉的TVB-N含量和菌落總數。基于標簽4的顏色測定數據，得到TVB-N含量的預測模型為Y=0.84X+1.07（R2=0.928 5）;菌落總數的預測模型為Y=0.8X+1.01（R2=0.923 0），模型預測精度良好。由于TVB-N含量和菌落總數是確定豬肉新鮮度的重要參數，因此偏最小二乘分析結果也表明指示標簽4在評估包裝豬肉新鮮度方面具有應用潛力。

3 結 論

為檢測豬肉在4 ℃冷藏條件下的新鮮度，選取3 種測定食品新鮮度指標的酸堿指示劑（溴甲酚紫、溴百里酚藍以及溴百里酚藍和甲基紅混合指示劑）制備6 種豬肉新鮮度指示標簽。本研究中使用的所有指示標簽在不同質量濃度的NH3環境中均發生了不同的顏色變化。將指示標簽用于監測豬肉的新鮮度變化，結果表明，指示標簽4

（初始pH值為4.24的溴甲酚紫指示劑）的顏色變化情況與貯存過程中TVB-N含量和菌落總數具有顯著相關性，即豬肉新鮮期呈金色、中等新鮮期呈棕黃色和腐敗期呈藍色，能夠用于實時監測豬肉的新鮮度變化。新鮮度指示標簽在豬肉保鮮和檢測方面具有較大的潛力，對密封包裝冷鮮豬肉的無損檢測方法提供了一定的參考。目前，我國將指示標簽應用于實時監測食品新鮮度的研究還處于起步階段，指示標簽對于包裝中其他氣體（如CO2等）以及其他肉類的顯色反應有待進一步研究。指示標簽作為一種新興監測技術，無疑將會為食品保鮮行業起到非常重要的助推作用。

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