等離子體活性水對生鮮黃魚殺菌效果及品質的影響

錢 婧,仲安琪,王露丹,趙穗潤,嚴文靜,章建浩

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

黃魚由于蛋白質含量高、肉質鮮嫩以及營養價值高等特點,其需求量日益增加,現已成為我國主要的海水養殖魚類[1]。但由于黃魚的肌肉組織疏松且蛋白含量高,易受到致腐致病微生物的污染而發生腐敗變質[2-3]。目前,凍藏保鮮技術是防止魚肉腐敗變質常用的方法[4-5],然而該技術只能抑制微生物的生長,一旦魚體在室溫下解凍后,魚體本身的微生物將繼續繁殖生長,破壞魚肉品質。因此,在魚體凍藏保鮮前進行簡單高效的初步殺菌顯得尤為重要,可降低后續的冷藏條件,減弱凍藏對魚肉品質的影響。

本研究利用等離子體射流發生裝置制備等離子體活性水,將魚肉中常見的腸道病原微生物腸炎沙門氏菌作為菌體模型[14],評估等離子體活性水的抗菌活性及抗菌時效,同時測定活性水中長效殺菌物質的含量。將制得的等離子體活性水用于生鮮黃魚的初步殺菌,以生鮮黃魚片(2.5 cm×5 cm,10 g)為研究對象。通過浸泡接種法(腸炎沙門氏菌),確保魚體表面初始微生物數量的一致性,進而探討等離子體活性水對生鮮黃魚片的殺菌效果,從色澤、pH、脂質氧化、亞硝酸鹽殘留、肌肉持水力及氣味多方面地揭示等離子體活性水對魚肉品質的影響,為等離子體活性水對黃魚初步殺菌的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮大黃魚 南京蘇果超市;腸炎沙門氏菌(SalmonellaenteritidisCICC24119) 中國工業微生物菌種保藏管理中心;LB肉湯、SS瓊脂(SalmonellaShigellaagar) 青島海博生物技術有限公司;Amplex? UltraRed試劑盒 賽默飛世爾科技公司;其他試劑均為國產分析純 南京壽德生物科技有限公司。

PG-1000ZD低溫等離子體噴槍 南京蘇曼等離子科技有限公司;Allegra-64R臺式冷凍離心機 美國貝克曼公司;SJ-CJ-1D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;SMIC型電熱滅菌鍋 上海醫用儀器廠;恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司;UV-2006 UV-Vis分光光度計 日本島津公司;數顯式pH測試儀 梅特勒-托利多儀器有限公司;IKA T25組織分散機 德國艾卡儀器設備有限公司;SpectraMax M2e多功能酶標儀 美國分子儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 等離子體活性水的制備及性能測定

1.2.1.1 等離子體活性水的制備 圖1為制備等離子體活性水所用的等離子體射流發生裝置示意圖。該裝置以空氣為工作氣體,流速為22.5 L/min,工作電流為0.024 mA,電壓為19 kV,頻率為20 kHz。本實驗將等離子體射流裝置的噴槍口位置固定于液面下方15 mm,待處理去離子水體積為1000 mL,處理一定時間(1、2、3 min)后,立即置于密閉容器中,在室溫(25 ℃)條件下儲藏,每隔4 h測定其理化性質(亞硝酸根、硝酸根、過氧化氫、pH)的變化情況。不同等離子體處理時間制得的等離子體活性水分別記為:PAW-1、PAW-2和PAW-3。

圖1 等離子體射流發生裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasma jet generator set-up

1.2.1.2 菌體懸濁液的制備 將腸炎沙門氏菌置于100 mL的LB肉湯中,37 ℃、180 r/min條件下培養15 h。取對數期的菌液離心(10000×g,6 min),去上清,用無菌生理鹽水清洗菌斑3次,再重懸于生理鹽水中。利用分光光度計測量600 nm波長下菌體懸浮液的吸光度值(OD),調整菌體懸濁液的濃度至108CFU/mL(相應的OD值為0.2)。

1.2.1.3 等離子體活性水抗菌時效的測定 將制備好的等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)室溫下儲藏24 h,每隔4 h測定其對腸炎沙門氏菌的抗菌效果。等離子體活性水與菌體懸濁液(108CFU/mL)按1∶1體積比進行混合,反應15 min后立即進行菌落數的測定,將去離子水處理作為對照組。對混合液進行10倍梯度稀釋,選擇3個適宜的稀釋度,分別吸取100 μL稀釋液于SS瓊脂平板上(每組3個),涂布均勻,置于37 ℃培養箱中培養24 h,以lg CFU/mL進行平板計數。

1.2.1.4 等離子體活性水中長效殺菌物質的測定 亞硝酸根及硝酸根含量按照國標 GB 5009.33-2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》進行測定。根據Amplex? UltraRed試劑盒的說明書測定等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)中過氧化氫的含量。在每100 μL的PAW中加入100 μL 10 mmol/L的試劑盒儲備液(含有辣根過氧化物酶),在37 ℃條件下反應15 min,利用酶標儀檢測其熒光強度(激發波長為540 nm,發射波長為590 nm)。

1.2.1.5 等離子體活性水pH的測定 pH計校正后,將電極分別浸沒在PAW-1,PAW-2及PAW-3溶液中,待讀數穩定后記錄數據。

1.2.2 等離子體活性水對生鮮黃魚品質的影響

1.2.2.1 樣品的制備及接種處理 采用無菌剪刀及手術刀在超凈臺內制備黃魚生魚片(2.5 cm×5 cm,10 g),將生魚片放在紫外燈下照射以除去魚原本的菌體(魚片每面用紫外燈照射各40 min)。紫外滅菌后將生魚片浸沒于腸炎沙門氏菌溶液(106CFU/mL)中30 s,取出,在超凈臺中室溫靜置4 h,使菌體附著于魚肉。

1.2.2.2 等離子體活性水處理 隨機抽取染菌生魚片(每組3片,每片10 g),浸沒于不同的等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)中30 s,取出,放置于無菌密封袋中后立即測定生鮮黃魚片上腸炎沙門氏菌的數量。隨機抽取未染菌生魚片(每組3片,每片10 g),浸沒于不同的等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)中30 s,取出,測定魚片在色澤、pH、TBARS、亞硝酸鹽、持水力、氣味以及味感上的變化情況。以去離子水浸泡處理為對照組,每個處理組重復3次。

1.2.2.3 腸炎沙門氏菌的測定 向裝有待測樣品的無菌袋中加入110 mL無菌生理鹽水,均質器以6次/s拍打2 min,10倍梯度稀釋,選擇3個適宜的稀釋度,分別吸取100 μL稀釋液于SS瓊脂平板上(每組3個),涂布均勻,置于37 ℃培養箱中培養24 h,以log CFU/g進行平板計數。

1.2.2.4 色澤的測定 利用以標準白板(L*=95.35,a*=0.01,b*=2.30)校正的色差儀對樣品的顏色特征進行評價。將色差儀垂直于樣品表面進行測量,每個樣品測量5個點,取其平均值。顏色值表示為L*(+亮度,-黑暗)、a*(+紅色,-綠色)和b*(+黃色,-藍色)[15]。

1.2.2.5 pH的測定 按照國標GB 5009.237-2016《食品安全國家標準 食品pH的測定》進行測定。

1.2.2.6 TBARS的測定 按照國標GB 5009.181-2016《食品安全國家標準食品中丙二醛的測定》進行測定。

1.2.2.7 亞硝酸鹽含量的測定 按照國標 GB 5009.33-2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》進行測定。

1.2.2.8 肌肉持水力的測定 將處理后的生鮮黃魚片剪碎(15±1 g,質量記為m1/g),分別置于50 mL離心管中,在20000 r/min、4 ℃條件下離心15 min后,記錄魚肉質量(m2/g)[16]。持水力計算公式如下:

式中:WHC表示魚體肌肉的持水力,%;m1表示離心前黃魚的總質量,g;m2表示離心后黃魚的總質量,g。

1.2.2.9 電子鼻的測定 將處理后的生鮮黃魚片剪碎(10±1) g,分別放入20 mL頂空瓶中。頂空瓶在37 ℃下水浴30 min,以達到穩定的頂空成分。在每次測量之前,傳感器室都要用空氣進行凈化,以便重新建立儀器的基線。頂空氣體以400 mL/min的速度泵入腔內。傳感器的采集時間為120 s,可以使傳感器響應信號達到穩定值。應用主成分分析法(PCA)對數據庫進行分析,以區分不同的處理方法[17]。

1.2.2.10 電子舌的測定 將處理后的生鮮黃魚片剪碎,每小塊約(5±1) g,分別放入100 mL離心管中,加入50 mL去離子水,高速勻漿30 s。制得的勻漿液在10000 r/min、4 ℃條件下離心15 min后,取上清,定容至100 mL,取80 mL用于電子舌分析。樣品測量的循環次數為4次,取后3次數據用于主成分分析(PCA)[18]。

1.3 數據處理

所有實驗均獨立重復三次,數據表示為平均值±標準差。采用SAS 8.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA),差異顯著性選擇鄧肯多重比較檢驗,P<0.05為差異顯著。采用Origin 8.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 PAW性質的測定

2.1.1 PAW抗菌活性及抗菌時效的測定 如圖2所示,在恒定的處理電壓及頻率條件下,隨著等離子體射流裝置處理時間的增加(儲藏時間為0 h),PAW的抗菌活性顯著增強(P<0.05)。經等離子體射流裝置處理1、2和3 min后,得到的PAW能使腸炎沙門氏菌的菌落數從原始的7.76lg CFU/mL(去離子水處理)分別降至7.21lg、5.81lg和4.72lg CFU/mL,分別降低了0.55lg、1.95lg和3.04lg CFU/mL(殺菌率分別為71.82%、98.88%和99.91%)。由此可見,PAW對食源性致病菌具有較好的抗菌作用,能夠顯著(P<0.05)降低菌落數,適合用于生鮮肉的清洗。等離子體活性水作為一種新型的抗菌液,具備抗菌效果的同時也應有一定的穩定性。從圖2中可知,PAW-1儲藏至4 h時,其抗菌性能與去離子水處理相比無顯著性差異,相比之下,PAW-3仍保持較好的抗菌性能,表明等離子體射流處理的時間越長,PAW的抗菌時效越長,且PAW的抗菌性能最高能夠保持8 h。

圖2 等離子體活性水對菌落數的影響Fig.2 Effects of plasma-activated wateron the number of live bacterium

圖3 等離子體活性水中長效物質的測定 Fig.3 Detection of long-lived species in plasma-activated water 注:小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖5～圖8同。

綜上可知,隨著等離子體處理時間的延長,PAW中的抗菌活性物質含量能夠增加;PAW中的過氧化氫與亞硝酸根反應形成的ONOOH雖具有較強的抗菌性能,但由于其化學性質的不穩定,抗菌時效很短;PAW儲藏過程中的抗菌性能主要歸因于亞硝酸根在酸性條件下分解形成的具有較強殺菌活性的NO·和NO2·。因此,PAW的抗菌性能相對穩定,并非是瞬時性的,對于產業應用具有一定的可行性。

2.2 PAW處理對生鮮黃魚品質的影響

2.2.1 PAW對生鮮黃魚的抗菌效果 如圖4所示,經PAW處理后,黃魚表面腸炎沙門氏菌的活菌數量顯著降低(P<0.05),且隨著等離子體射流處理水時間的增加,其抗菌效果顯著(P<0.05)增加。經PAW-1、PAW-2和PAW-3浸泡后,黃魚表面的沙門氏菌數從5.26lg CFU/g(去離子水處理)分別降低至5.15lg、4.98lg和4.14lg CFU/g,其中PAW-3抗菌效果最顯著(P<0.05),可使黃魚表面沙門氏菌細菌數降低1.12lg CFU/g,殺菌率達92.41%,因魚肉組織結構的影響,殺菌率略低于純菌液的殺菌效果。經去離子水、PAW-1、PAW-2和PAW-3處理后的魚片在4 ℃條件下儲藏24 h后,黃魚表面的沙門氏菌菌落數分別為6.21lg、6.07lg、5.78lg和5.49lg CFU/g,表明等離子體活性水中的抗菌物質(酸性亞硝酸鹽:NO·、NO2·)能夠有效地抑制魚肉儲藏過程中微生物的生長。綜上可知,魚肉經過PAW簡單的浸泡便可實現快速高效的殺菌效果,更利于魚肉的儲藏。

圖4 不同等離子體活性水對菌落數的影響 Fig.4 Effects of various types of PAWon the number of live bacterium

2.2.2 PAW對生鮮黃魚色澤的影響 肉的顏色是消費者用來評判肉質量及新鮮度的重要指標[30],本文利用色差儀測定經PAW浸泡后生鮮黃魚片的表面色澤。表1表明,經PAW浸泡后,魚肉的L*和a*值降低,b*值增加,但與對照組相比并無顯著性差異(P>0.05)。由此表明,PAW不會引起魚肉的肉色發生顯著變化。

表1 不同等離子體活性水處理對黃魚表面色澤的影響Table 1 Effects of various types of PAWon the surface color of yellow croaker

2.2.3 PAW對生鮮黃魚pH的影響 圖5為不同PAW處理對黃魚pH的影響,從圖5中可以看出,PAW處理對魚肉pH的影響較小。PAW-3 浸泡后的魚肉,其pH從6.54降低至6.45,表明魚片經PAW浸泡處理后,PAW本身的低pH特性并不會影響魚肉的pH。同時由于魚肉本身呈酸性[31],pH6.45并不會顯著影響肉的品質,同時低pH的環境能抑制微生物的生長。

圖5 不同等離子體活性水對黃魚pH的影響Fig.5 Effect of various types of PAWon the pH of yellow croaker

2.2.4 PAW對生鮮黃魚TBARS值的影響 等離子體中的長效物質或者自由基可通過從脂質分子中提取氫離子開啟脂質氧化過程[32],Kim和孟婧怡等也指出豬肉經等離子體處理后其脂質氧化情況顯著增強[33-34]。本實驗利用TBARS值評估不同種等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)對魚肉脂質氧化的影響。如圖6所示,隨著等離子體處理水時間的延長,魚肉中TBARS含量增加。當等離子體射流處理水的時間增至3 min時,魚肉的丙二醛含量從0.30增至0.34 mg/kg,表明此時等離子體活性水中的活性物質或通過后續反應形成的自由基,可能會破壞脂肪酸的功能,引起脂質氧化[35]。Greene等指出當鮮肉中的丙二醛含量在0.6 mg/kg以上時會對肉的感官品質及風味造成影響[36]。本實驗中PAW處理后魚肉的丙二醛含量遠遠低于該值,表明PAW浸泡不會對生鮮黃魚片的脂肪氧化產生影響。

圖6 不同等離子體活性水對黃魚TBARS值的影響Fig.6 Effect of various types of PAWon the TBARS values of yellow croaker

2.2.5 PAW對生鮮黃魚亞硝酸鹽含量的影響 本文通過檢測黃魚中亞硝酸鹽的含量來判斷PAW處理是否會造成過量的亞硝酸鹽殘留。如圖7所示,魚肉經水及PAW-1、PAW-2和PAW-3處理后,魚肉的亞硝酸鹽含量分別為0.23、0.35、0.43和0.49 mg/kg,雖然PAW浸泡后黃魚中亞硝酸鹽的含量有所增加,但均遠遠低于限量值(30 mg/kg)[37],表明魚片經PAW浸泡處理后,PAW中的部分亞硝酸根雖會吸附在魚片表面卻不會造成嚴重殘留,因此不會對人體健康造成危害。另外,在儲藏過程中,硝化還原菌的作用遠弱于細菌亞硝酸鹽還原酶,亞硝酸鹽被還原為一氧化氮,導致亞硝酸鹽的減少的同時也能夠起到抗菌作用[38]。

圖7 不同等離子體活性水對黃魚亞硝酸鹽含量的影響Fig.7 Effect of various types of PAWon the nitrite content of yellow croaker

2.2.6 PAW對生鮮黃魚肌肉持水力的影響 魚體肌肉的持水力與其嫩度及質構等品質密切相關[39],如圖8所示,經去離子水及三種等離子體活性水處理后,魚肉的持水力分別為76.0%、75.1%、73.4%及72.9%。與去離子水處理組相比,等離子體活性水處理降低了魚肉的持水力,但并未產生顯著性差異,表明等離子體活性水中的氮氧自由基(NO·、NO2·)并不會對肌肉蛋白的空間結構造成嚴重破壞,導致肌原纖維間隙中的水分的過量流失[40]。

圖8 不同等離子體活性水對黃魚肌肉持水力的影響Fig.8 Effect of various types of PAWon the water holding capacity of yellow croaker

2.2.7 PAW對生鮮黃魚氣味及味感的影響 如圖9A所示,兩個主成分PC1和PC2代表了電子鼻數據庫中89.5%的信息,且二維主成分分析(PCA)圖能較好地區分不同處理后魚肉的氣味。PC1解釋了傳感器響應的主要差異,水、PAW-1、PAW-2和PAW-3處理組的樣品沿PC1軸依次排列,但并未過度分散,表明隨著等離子體處理時間的增加,等離子體活性水中的活性物質會對魚肉的氣味造成影響,當等離子體處理時間在3 min以內時對魚肉氣味的影響并不顯著。

如圖9B所示,兩個主成分PC1和PC2代表了電子舌數據庫中75.8%的信息,因此可反映樣品的絕大部分信息。水、PAW-1、PAW-2和PAW-3處理組的數據點大部分出現重疊,并不能明顯地區分開,可見處理組之間的味感信息具有很大的相似性,表明魚片經等離子體活性水浸泡后并不會對其味感產生顯著的影響。

圖9 不同等離子體活性水對黃魚(A)氣味及(B)味感的影響Fig.9 Effects of various types of PAWon the(A)odor and(B)taste of yellow croaker

3 結論