狗源性DNA檢測試劑盒的研制與評價

王天添,劉佳琳,李亞晗,王艷雙,李明成,3,孫麗媛,*

(1.北華大學醫學技術學院,吉林吉林 132013; 2.北華大學醫學院,吉林吉林 132013; 3.吉林省中藥DNA指紋檢測技術科技創新中心,吉林吉林 132013)

狗肉,又叫“香肉”、“白狗”,有至尊腎寶的美譽,口感細嫩,肉質密且飽滿。《本草綱目》中記載,“狗肉滋氣補血,行二經而瞬時暖胃祛寒,服之氣血溢沛,百脈沸騰”[1]。由于純正的食用狗肉數量稀少,價格昂貴,很多不法商販用非法狩獵或者養殖場淘汰的毛皮動物肉替代。近年來,有毒狗肉“鏈”上餐桌事件屢屢發生[2]。目前市面上最常見摻假狗肉的偽品為狐肉、貂肉,也是最可能對人體存在危害性的兩大摻假物種。2011年12月8日,沈陽晚報記者曾暗訪所謂低價的“正宗狗肉”店,發現其醬狗肉其實就是狐貍肉和貉子肉。據統計,我國北方狐、貂年飼養量近10000萬只。作為皮毛經濟動物,養殖過程中添加激素類飼料不可避免,甚至定期注射抗生素藥品,致使動物體內殘留超標的激素及抗生素藥物。失去毛皮的狐肉、貂肉被不法商販大量低價收購,摻假到價格較高、特別是與其種屬相近的狗肉中[3]。此類摻假狗肉一旦作為食品進入市場,不僅損害消費者的身體健康,而且嚴重侵犯消費者權益。本研究主要針對這兩種摻假肉研制試劑盒,用以檢測狗肉中是否摻雜狐肉、貂肉。

隨著科學技術的發展,越來越多的檢測技術被應用于摻假肉類檢測[4-12],在眾多檢測方法中,基于DNA序列的種屬特異性強的PCR技術應用最為廣泛,包括傳統PCR、多重PCR、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)以及數字PCR(Digital PCR)。PCR-RFLP需要設計特異性酶進行鑒別,但酶切位點易發生隨機突變,重復性較差;實時熒光定量PCR和數字PCR準確度高,靈敏性強,但所需儀器較為昂貴,不易普及;傳統PCR以及多重PCR相對來說操作更為簡單便利,所需儀器價格更為經濟,適用于基層單位。

本研究應用物種特異性PCR技術研制狗源性DNA檢測試劑盒,選取高靈敏度、高特異性的狗、狐、貂源性引物組裝試劑盒,以期達到準確檢測狗肉及其偽品(狐肉、貂肉)的目的,廣泛應用于狗肉質量標準檢測,為狗肉質量監管提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

狗、狐、貂肉標準品 本省食品藥品檢測中心;市售樣品 當地超市、農貿市場、以及網絡店鋪;2×Taq PCR MasterMix、100 bp DNA Marker、λDNA HindIII、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、質粒小提試劑盒、pGM-T連接試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞 北京天根生化科技有限公司;其他試劑 國產分析純。

MX-S型漩渦混勻器 美國賽洛捷克公司;DKT200-1型恒溫金屬浴 美國科路森科學實驗儀器有限公司;JY300E通用型電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司;TC9600-G多功能梯度PCR儀 美國Labnet公司;UV WHITE-2020D紫外凝膠成像分析儀 美國Biorad公司;NanoDrop One微量核酸蛋白測定儀、Thermo Fisher高速離心機 美國Thermo公司;ZW-800G全封閉智能勻漿儀 溫州維科生物實驗設備有限公司;YXQ-LS-75S11立式蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 狗源性DNA成分檢測

1.2.1.1 DNA提取 根據試劑盒手冊,稱取待測樣品約0.05 g,分別置于干凈Ep管中,依次加入P1(Tris-HCl、EDTA、NaCl、10% SDS、PK酶和ddH2O)溶液500 μL、P2(10% SDS)溶液30 μL、P3(PK 酶)溶液15 μL,混勻,56 ℃水浴振蕩1 h;加入P4(飽和乙酸鈉)溶液500 μL,充分混勻10 min,10000 r/min離心10 min;取上清液加入等體積P5(異丙醇)溶液,-20 ℃放置10 min,10000 r/min離心10 min;棄上清液,加入70%冰凍乙醇溶液500 μL,混勻,11000 r/min離心10 min,棄上清液(重復該步驟1次);室溫晾干后,加入P6(ddH2O)溶液100 μL溶解DNA,混勻,即得肉樣DNA溶液。

1.2.1.2 DNA濃度、純度檢測 紫外分光光度計測待檢DNA濃度,每個樣品測定3次,取平均值,根據OD260/280比值計算待檢DNA純度。

1.2.1.3 特異性引物設計 GenBank中下載狗種屬基因序列(GenBank:KU291093.1)、狐貍種屬基因序列(GenBank:LT560065.1)、貂種屬基因序列(GenBank:KU146454.1),應用NCBI Primer BLAST在線引物設計軟件設計狗、狐貍、貂種屬特異性引物(見表1),送至深圳華大基因科技服務有限公司合成。

表1 特異性引物序列Table 1 Specific primer sequence

1.2.1.4 PCR反應 PCR反應體系:2×Taq PCR Master Mix 10 μL,引物 F、R(10 ng/μL)各1 μL,DNA 模板(10 ng/μL)1 μL,無菌ddH2O補足至20 μL。PCR反應參數:94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 個循環;72 ℃延伸 10 min,4 ℃保存。

1.2.1.5 PCR產物檢測 1.5% 瓊脂糖凝膠,85 V/cm 電泳85 min，紫外分析儀觀察。正品狗肉應在481 bp處有單一明亮條帶。

1.2.1.6 種屬特異性基因片段克隆 凝膠回收狗、狐、貂特異性DNA片段,純化、連接后轉入大腸桿菌感受態細胞DH5α,藍白篩選陽性克隆;經測序驗證,分析比對結果,將經 PCR 鑒定后的質粒稀釋至10 ng/μL作為試劑盒的陽性對照。

1.2.2 狗源性DNA檢測試劑盒組裝 試劑盒為20次用量,包括DNA提取體系和PCR擴增體系(見表2)。

表2 狗肉DNA檢測試劑盒組成Table 2 DNA detection kit of dog meat

1.2.3 狗源性DNA檢測試劑盒評價

1.2.3.1 特異性評價 檢驗人員在對樣品真偽不知情的情況下,對隨機批次樣品進行盲檢驗證試劑盒特異性。

1.2.3.2 穩定性評價 從已配置完善的試劑盒中隨機抽取2份,一份于室溫和-20 ℃反復凍融5、10、15 和 20 次,一份于制備后的當日及每間隔3個月,檢測試劑盒各試劑穩定性、有效性,分別檢測狗肉正品、摻假品及陽性、陰性對照品各1次,直至檢測結果與真實結果不符為止。

1.3 數據處理

PCR擴增產物凝膠電泳圖譜均由紫外透射反射分析儀進行成像分析,使用Photoshop CS6進行處理。

2 結果與分析

2.1 狗肉、狐貍肉、貂肉基因組DNA提取結果

0.8%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,各泳道均可得到20000 bp左右的DNA條帶,條帶清晰,抹帶較少,證明本方法提取的DNA質量高,碎片較少,可成功提取狗肉等基因組DNA(見圖1)。

圖1 狗肉、狐肉、貂肉基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Genomic DNA agarose gel electrophoresis ofdog meat,fox meat and scorpion meat注:M:λHindIII Marker;1:狗;2:狗;3:狐;4:狐;5:貂;6:貂;N:空白對照。

2.2 狗肉、狐貍肉、貂肉DNA濃度及純度

紫外分光光度計測定,所提取DNA濃度皆不低于100 ng/μL,OD260/280值均居于1.80～2.10之間,證明本方法可有效提取狗肉等基因組DNA(見表3)。

表3 狗肉、狐肉、貂肉DNA濃度及純度檢測結果Table 3 DNA concentration and purity ofdog meat,fox meat and clam meat

2.3 引物特異性試驗結果

狗、狐、貂所對應泳道分別在481、393、289 bp處出現單一特異性條帶,清晰明亮,證明引物具有良好特異性(見圖2)。

圖2 狗肉、狐肉、貂肉引物特異性試驗瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of cockroach primerspecific test of dog meat,fox meat,and clam meat注:M:100 bp DNA Ladder;1:狗;2:狗;3:狐;4:狐;5:貂;6:貂;N:空白對照。

2.4 引物靈敏性試驗結果

DNA稀釋至10-4ng/μL時,仍可在481 bp處見淺帶,證明引物具有良好靈敏性,最低檢測限為10-4ng/μL(見圖3)。

圖3 狗肉引物靈敏性試驗瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 Agarose gel electrophoresis ofprimer sensitivity of dog meat注:M:100 bp DNA Ladder;1:100 ng/μL;2:10 ng/μL;3:1 ng/μL;4:10-1 ng/μL;5:10-2 ng/μL;6:10-3 ng/μL;7:10-4 ng/μL;8:10-5 ng/μL;9:10-6 ng/μL;10:10-7 ng/μL;N:空白對照。

2.5 克隆結果及比對結果

經過NCBI-BLAST 比對,所測狗、狐、貂核苷酸序列分別與GenBank中已登記的狗、狐、貂相似性為100%,證明所克隆DNA片段即為目的基因片段。

2.6 狗源性DNA檢測試劑盒評價

2.6.1 特異性評價 正品均在481 bp處出現單一特異明亮條帶,偽品均未出現條帶,證明該試劑盒具有良好特異性(見圖4)。

圖4 試劑盒特異性試驗瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of kit specific test 注:M:100bp DNA Ladder;1:狗,陽性對照;2:狐,陽性對照;3:貂,陽性對照;4:狗;5:狐;6:貂;N:空白對照;圖5～圖9同。

2.6.2 穩定性評價 試劑盒反復凍融5、10、20 次后,均可成功提取狗肉DNA,并擴增出481 bp的目的條帶;-20 ℃保存試劑盒1年,期間每3個月檢測一次,結果均一致,證明本試劑盒反復凍融20次或在-20 ℃保存一年,仍可有效檢測(見圖5、圖6)。

圖5 試劑盒特異性試驗瓊脂糖凝膠電泳結果(反復凍融20次)Fig.5 Agarose gel electrophoresis results of Kit specifictest(Repeated freezing and thawing 20 times)

圖6 試劑盒特異性試驗瓊脂糖凝膠電泳結果(-20 ℃保存一年)Fig.6 Agarose gel electrophoresis resultsofkit specific test(-20 ℃ for one year)

2.7 市售樣品檢測

應用本研究所研制試劑盒對12份隨機狗肉樣本進行鑒別檢測,檢出3份偽品。如圖7,5號泳道見393 bp的單一條帶,與2號泳道狐-陽性對照所顯現條帶位置相同,說明為狐肉冒充的偽品狗肉;如圖8所示,5、6號泳道皆見單一條帶(393、289 bp),分別于左側2、3號泳道狐-陽性對照、貂-陽性對照條帶位置相同,說明此份樣品同時摻雜狐、貂源性成分;圖9中僅6號泳道見289 bp單一條帶,則為貂肉冒充的偽品狗肉;剩余樣品皆無狐、貂源性成分摻假。

圖7 市售樣品檢測瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.7 Agarose gel electrophoresis resultsof commercial sample detection

圖8 市售樣品檢測瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.8 Agarose gel electrophoresis resultsof commercial sample detection

圖9 市售樣品檢測瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.9 Agarose gel electrophoresis resultsof commercial sample detection

3 討論

隨著狗肉的眾多食用藥用價值被發現,愈來愈多人喜食狗肉[13],同時,狗肉摻假現象也日漸增多[14]。PCR技術廣泛應用于肉制品檢測,尤其用以鑒別豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉等常見肉居多[15-22],但鑒別摻假狗肉的研究少之又少。高曉麗等[22]應用熒光PCR技術對食品中狗源性成分進行檢測,以狗ND2基因特異性引物對豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉等14中動物源性DNA進行擴增,但未提及現今最常見狗肉摻假物種(狐肉、貂肉);劉艷艷等[3]建立了飼料中狐貍、水貂、狍子狗源性成分的熒光PCR檢測方法,用以檢測反芻動物飼料中狐貍、水貂、貉子及狗源性成分,但未涉及食用肉制品中狐、貂源性成分檢測,并且熒光PCR技術雖檢測靈敏度高、特異性好,但所需檢測試劑、儀器皆較為昂貴,實驗操作較復雜,不易于普及,本研究應用常規PCR技術,對狗肉及最常見狗肉偽品(狐肉、貂肉)進行鑒別檢測,最低成本下保證檢測結果準確性,更易于普及基層。

本研究以線粒體的細胞色素B區域基因為靶基因設計種屬特異性引物,為獲得高純度的DNA,對SDS 堿變性法及提取步驟進行了優化,可有效沉淀蛋白質,提高DNA提取效率,且提取結果穩定,OD260/280可達2.02±0.009,操作簡便,安全無毒。通過對反應體系及條件摸索,確定Tm值為56,引物模板量為1 μL時,PCR擴增效率最高,正品狗肉皆在481 bp處出現單一明亮條帶,偽品無相應條帶。靈敏性試驗表明,在模板濃度低至10-4ng/μL時,仍可出現特異淺帶。對隨機抽取的12份樣品進行試劑盒檢測,有1份摻雜狐肉,1份為狐肉、貂肉混合偽品,1份為貂肉偽品。該結果與食品藥品檢驗中心結果一致,證明本試劑盒具有良好準確性及特異性。反復凍融試劑盒20次,仍可實現穩定檢測。

4 結論

本文所研發狗源性DNA檢測試劑盒具有良好特異性、靈敏性以及穩定性,可于4.5 h內完成全部檢測,且在同一反應體系中同時檢測狗、狐、貂三種成分。-20 ℃保存1年,仍能穩定檢測。相較其他常見摻假肉類鑒別方法,該試劑盒不僅準確度高、特異性好、靈敏性強,而且可操作性高,更易普及,可以很大程度上減輕質檢工作人員的工作量。由于試劑盒的形式更為便捷,使操作人員及地點不受限制,可廣泛應用到狗肉的質量監督工作中,在肉制品質量考察方面具有廣泛的應用前景。未來本團隊將進一步完善該試劑盒,更大程度上提高檢測效率,節省檢測成本。