響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌Bacillus cereus B03的發(fā)酵條件

陳 成,寧喜斌,2,3,4,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海),上海 201306; 4.國(guó)家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海),上海 201306)

《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)β-內(nèi)酰胺酶定義為:能裂解青霉素和頭孢菌素類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán),使其滅活的水解酶稱為β-內(nèi)酰胺酶[1]。隨著核苷酸序列信息的增多,已鑒定的β-內(nèi)酰胺酶的數(shù)量已接近指數(shù)增長(zhǎng),β-內(nèi)酰胺酶數(shù)據(jù)庫(kù)含有超過(guò)4300種經(jīng)過(guò)不同程度表征的酶[2-3]。β-內(nèi)酰胺類抗生素由于藥效快、作用范圍廣、毒性低等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用在食品加工、畜牧飼養(yǎng)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等與人類生活息息相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域。β-內(nèi)酰胺酶因其具有水解β-內(nèi)酰胺類抗生素中β-內(nèi)酰胺環(huán)的特點(diǎn),不僅應(yīng)用在前藥的開發(fā)與抗體定向酶前藥治療領(lǐng)域,也可與生物傳感器、ELISA檢測(cè)等結(jié)合檢測(cè)乳及乳制品中殘留的抗生素[4-7]。β-內(nèi)酰胺酶不僅可以清除醫(yī)療器械、環(huán)境中抗生素的殘留,也用于食品(特別是乳及乳制品)、飲用水和環(huán)境中殘留抗生素的檢測(cè),為食品安全及公眾健康提供重要的保障。

目前,國(guó)內(nèi)報(bào)道的關(guān)于此類酶的培養(yǎng)基優(yōu)化方面,都是單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)合,還未見有關(guān)響應(yīng)面法優(yōu)化的報(bào)道[8-10]。響應(yīng)面方法(RSM)結(jié)合了統(tǒng)計(jì)和數(shù)學(xué)技術(shù),是基于經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合,通過(guò)使用從適當(dāng)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)中獲得的定量數(shù)據(jù)來(lái)優(yōu)化提取過(guò)程[11-12]。岳喜慶等[13]采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)霍氏腸桿菌WM1產(chǎn)青霉素酶的培養(yǎng)基條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到的產(chǎn)酶活力最高為1.15×104U/(mL·h)。魏寶東等[8]通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化大腸桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成,β-內(nèi)酰胺酶活力達(dá)到2648.95 nkat,比優(yōu)化前提高了18%。國(guó)內(nèi)報(bào)道的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株存在產(chǎn)酶量較低的問(wèn)題,且單因素試驗(yàn)無(wú)法得知各因素之間的交互影響,正交試驗(yàn)只能得到最佳因素水平組合,而響應(yīng)面法則可更為合理的以有效、經(jīng)濟(jì)的方式設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,考慮實(shí)驗(yàn)的隨機(jī)誤差,對(duì)實(shí)驗(yàn)分析更加全面[14]。

本研究在前期菌株篩選的基礎(chǔ)上,結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)以及Box-Behnken中心組合試驗(yàn)三種優(yōu)化方法,旨在快速高效地提高菌株BacilluscereusB03的產(chǎn)酶能力,以期為進(jìn)一步工業(yè)化開發(fā)利用性狀穩(wěn)定且高產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株提供借鑒,為工業(yè)生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶及其應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株BacilluscereusB03 由實(shí)驗(yàn)室前期于上海市第六人民醫(yī)院(臨港地區(qū))分離篩選所得,保存于-80 ℃冰箱;蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏 生工生物工程(上海)股份有限公司;氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂及其他實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 5,調(diào)pH7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,NaCl 4,MgSO4·7H2O 0.5,K2HPO4·3H2O4,調(diào)pH7.5。

GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱、THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DGG-9203AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HWT-20C恒溫水浴箱 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司;pH730臺(tái)式pH精密測(cè)試儀 德國(guó)WTW;TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;AL204精密電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;AC2-S超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司;

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 菌株活化:將在-80 ℃冰箱中甘油保藏的菌株置于冰上解凍復(fù)蘇,接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基活化培養(yǎng)18～24 h,然后接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24 h。

液體種子培養(yǎng):將活化的斜面菌種挑取一環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基中,250 mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基100 mL,溫度37 ℃,160 r/min培養(yǎng)24 h。

搖瓶培養(yǎng):250 mL三角瓶裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,將種子液按3%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,溫度37 ℃,180 r/min培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。

1.2.2 菌體干重測(cè)量 將搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后的菌液置于離心管中,9000 r/min離心10 min后,去掉上清液,再用無(wú)菌水洗滌2～3次并離心。菌體置于105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重稱其質(zhì)量。

1.2.3β-內(nèi)酰胺酶活力測(cè)定方法β-內(nèi)酰胺酶粗酶液制備:搖瓶培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)高速離心機(jī)以9000 r/min離心10 min,所得上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌,其過(guò)濾液即為無(wú)菌β-內(nèi)酰胺酶粗酶液。

β-內(nèi)酰胺酶活力測(cè)定:β-內(nèi)酰胺酶活力測(cè)定參考《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年第四版);1個(gè)酶活力單位定義為:在37 ℃條件下,1 mL發(fā)酵酶液每小時(shí)分解青霉素活性單位的量,用U表示[1]。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 碳源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發(fā)酵瓶中,發(fā)酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油為碳源,添加量為20 g/L,其他培養(yǎng)基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。根據(jù)選定的最佳碳源,分別以不同濃度的葡萄糖(1%、2%、3%、4%、5%)配制發(fā)酵培養(yǎng)基,測(cè)定碳源濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.2 氮源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發(fā)酵瓶中,發(fā)酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別使用酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、硫酸銨、脲為氮源,添加量為20 g/L,其他培養(yǎng)基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。根據(jù)選定的最佳氮源,分別以不同濃度的酵母浸粉(1%、2%、3%、4%、5%)配制發(fā)酵培養(yǎng)基,測(cè)定氮源濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.3 溫度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發(fā)酵瓶中,發(fā)酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別調(diào)整溫度為28、31、34、37、40、43 ℃,pH7.5、180 r/min條件下培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.4 發(fā)酵初始pH對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發(fā)酵瓶中,發(fā)酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別調(diào)整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.5 接種量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的影響 將種子液分別以不同的接種量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)接入發(fā)酵瓶中,發(fā)酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.6 裝液量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的影響 通過(guò)改變相同規(guī)格的250 mL三角瓶中的裝液量來(lái)改變?nèi)苎鯘舛取⒎N子液以3%的接種量接入發(fā)酵瓶中,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),發(fā)酵瓶裝液量依次為20、30、40、50、60、70、80 mL,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.7 金屬離子對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發(fā)酵瓶中,發(fā)酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別添加濃度為0.5 g/L的不同金屬離子(Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+),其他培養(yǎng)基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。根據(jù)選定的金屬離子,分別以不同濃度的MgSO4·7H2O(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)配制發(fā)酵培養(yǎng)基,測(cè)定金屬離子濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.8 K2HPO4·3H2O對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發(fā)酵瓶中,發(fā)酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別添加不同濃度的K2HPO4·3H2O(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%),其他培養(yǎng)基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.9 NaCl對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發(fā)酵瓶中,發(fā)酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別添加不同濃度的NaCl(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%),其他培養(yǎng)基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養(yǎng)40 h,測(cè)定發(fā)酵液酶活和菌體干重。

1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取9個(gè)影響因素作為研究對(duì)象,以β-內(nèi)酰胺酶酶活(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行試驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì),P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見表1。每個(gè)因素分別取低(-1)和高(+1)兩個(gè)水平,另設(shè)A0虛擬因素列以考察實(shí)驗(yàn)誤差。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)變量Table 1 Process variables used in Plackett-Burman design

1.3.2 中心組合Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選出三個(gè)顯著性因素,即溫度(A)、pH(B)、接種量(C)。采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì),以溫度(A)、pH(B)、接種量(C)為自變量,以酶活力(Y)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn),中心組合試驗(yàn)方案中的因素及水平如表2所示,數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析[15-16]。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)用GraphPad軟件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和制圖,利用Minitab 17軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)中心組合Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)和分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 最佳碳源的確定 如圖1所示,當(dāng)葡萄糖作為唯一碳源時(shí),菌株B03產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的酶活最高,乳糖次之,蔗糖作為碳源時(shí),酶活最低。菌體干重大小也與各個(gè)碳源酶活的高低基本呈正比變化。隨著葡萄糖含量的增加,當(dāng)葡萄糖含量為2%時(shí),產(chǎn)酶活力最高,進(jìn)一步提高葡萄糖濃度酶活力下降。葡萄糖含量為4%時(shí),菌體干重雖然達(dá)到最大值,但酶活不高,故選擇含量為2%的葡萄糖作最適碳源,即20 g/L。

圖1 不同的碳源及葡萄糖濃度對(duì)菌體干重及β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.1 Effects of different carbon sources and glucoseconcentrations on dry cell weight and activity of β-lactamase注:不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同組間差異顯著(P<0.05);圖2～圖9同。

2.1.2 最佳氮源的確定 如圖2所示,當(dāng)有機(jī)氮(如蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏)作氮源時(shí),菌株B03產(chǎn)酶量整體高于無(wú)機(jī)氮(如硫酸銨、脲)作氮源時(shí)的產(chǎn)酶量。有機(jī)氮作氮源時(shí)較無(wú)機(jī)氮作氮源時(shí)的菌株產(chǎn)酶量不僅存在顯著性差異(P<0.05),且其菌體干重較無(wú)機(jī)氮源的菌體干重也存在顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更適合菌體生長(zhǎng)。當(dāng)使用酵母浸粉作為氮源時(shí),菌株產(chǎn)酶活力最高且菌體干重最大。隨著酵母浸粉含量的增加,當(dāng)酵母浸粉含量為2%時(shí),產(chǎn)酶活力最高,進(jìn)一步提高酵母浸粉濃度酶活力下降。酵母浸粉含量為3%時(shí),菌體干重雖然達(dá)到最大值,但酶活已處下降趨勢(shì),故選擇含量為2%的酵母浸粉作最適氮源,即20 g/L。

圖2 不同的氮源及酵母浸粉濃度對(duì)菌體干重及β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sourcesand yeast extract concentrations on dry cellweight and activity of β-lactamase

2.1.3 最佳溫度的確定 如圖3所示,隨著溫度的升高菌體干重及酶活都呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為28～37 ℃時(shí),酶活及菌體干重呈上升的趨勢(shì);當(dāng)溫度為37 ℃時(shí),酶活力最高,菌體干重也達(dá)到最大;當(dāng)溫度大于37 ℃時(shí),酶活呈直線下降的趨勢(shì)。因此,確定37 ℃為菌株B03產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的最佳發(fā)酵溫度。

圖3 溫度對(duì)菌體干重及β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.3 Effects of temperature on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.4 最佳pH的確定 如圖4所示,培養(yǎng)基初始pH為7.0時(shí),酶活力最高,菌體干重也達(dá)到最大,對(duì)菌株B03產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶最有利。過(guò)酸和過(guò)堿都會(huì)影響菌體的增長(zhǎng)及菌株產(chǎn)酶的能力。因此,確定pH7.0為菌株B03產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的最佳pH。

圖4 pH對(duì)菌體干重及β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.4 Effects of pH on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.5 最佳接種量的確定 如圖5所示,當(dāng)接種量為1%～3%時(shí),菌體大量增殖,酶活力也呈直線上升,3%時(shí)酶活達(dá)到最大。隨著接種量的增加,在4%時(shí)菌體干重達(dá)到最大,但由于培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)度消耗影響了菌株的產(chǎn)酶能力,導(dǎo)致酶活力下降。因此,確定3%為菌株B03產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的最佳接種量。

圖5 接種量對(duì)菌體干重及β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.5 Effects of inoculum on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.6 最佳裝液量的確定 如圖6所示,裝液量的多少主要影響菌株對(duì)溶氧的需求,進(jìn)而影響菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶能力。當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時(shí),菌體干重及酶活都達(dá)到最大,裝液量增加或減少,菌體干重及酶活都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此,確定50 mL/250 mL為菌株B03產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的最佳裝液量。

圖6 裝液量對(duì)菌體干重及β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.6 Effects of liquid volume on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.7 最佳金屬離子的確定 如圖7所示,微生物生長(zhǎng)與生產(chǎn)過(guò)程中,許多金屬離子都可作為輔助因子影響微生物的生長(zhǎng)代謝,也會(huì)影響微生物的產(chǎn)酶能力。從圖7可以看出,相比其他金屬離子,鎂離子對(duì)菌體生長(zhǎng)及菌株產(chǎn)酶影響較大,酶活最高。因此,確定鎂離子為菌株B03產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的最佳金屬離子。不同濃度的MgSO4·7H2O對(duì)菌體干重及酶活的影響不顯著,其中加入0.2 g/L的MgSO4·7H2O時(shí)有最大酶活。

圖7 不同金屬離子及MgSO4·7H2O濃度對(duì)菌體干重及β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.7 Effects of different metal ions and MgSO4·7H2Oconcentrations on dry cell weight and activity of β-lactamase

2.1.8 最佳K2HPO4·3H2O濃度的確定 如圖8所示,當(dāng)K2HPO4·3H2O濃度為0.4%時(shí),菌體干重及酶活都達(dá)到最大。隨著K2HPO4·3H2O濃度的加大,菌體干重及酶活呈現(xiàn)階梯型下降的趨勢(shì)。因此,確定0.4%為菌株B03產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的最佳K2HPO4·3H2O濃度。

圖8 不同K2HPO4·3H2O濃度對(duì)菌體干重及β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.8 Effect of different K2HPO4·3H2O concentrationson dry cell weight and activity of β-lactamase

2.1.9 最佳NaCl濃度的確定 如圖9所示,隨著NaCl濃度的增加,酶活基本呈曲線下降的趨勢(shì),雖然菌體干重在NaCl濃度為0.4%時(shí)達(dá)到最大,但影響了菌株產(chǎn)酶能力。因此,確定0.2%為菌株B03產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的最佳NaCl濃度。

圖9 不同NaCl濃度對(duì)菌體干重及β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.9 Effect of different NaCl concentrationson dry cell weight and activity of β-lactamase

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)Plackett-Burman(N=12)實(shí)驗(yàn),對(duì)影響β-內(nèi)酰胺酶發(fā)酵工藝中的9個(gè)因素的顯著性進(jìn)行考察。試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。利用Minitab17軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行主效應(yīng)分析,結(jié)果見表4。從表4中可以看出顯著的三個(gè)因素為溫度、pH、接種量,P值分別為0.027、0.046、0.039均小于0.05。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的各因素水平及主效應(yīng)分析Table 4 Factors,levels and significance analysis of Plackett-Burman design

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與回歸模型的方差分析 以溫度(A)、pH(B)、接種量(C)為考察因素,以酶活力(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),試驗(yàn)結(jié)果見表5。利用Design Expert軟件對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到模型的二次回歸方程:

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及其結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken

Y=1.122×105-711.07A+8378.41B-2287.83C-803.85AB-1484.00AC+865.68BC-13423.91A2-8353.60B2-21895.05C2。

式中:Y,β-內(nèi)酰胺酶的預(yù)測(cè)活力(U/mL);A、B、C,分別代表溫度(℃)、pH和接種量(%)。

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

2.3.2 響應(yīng)面曲線及等高線分析 根據(jù)Design Expert軟件分析出三種顯著影響因素溫度、初始pH、接種量的響應(yīng)面和等高線結(jié)果見圖10。由各因素響應(yīng)面曲線圖可知,皆呈開口向下的拋物線形狀,說(shuō)明存在響應(yīng)最大值。響應(yīng)面曲線的陡緩程度和等高線的形狀都可以反應(yīng)因素交互作用的強(qiáng)弱。響應(yīng)面曲線走勢(shì)越陡,表明影響越顯著;響應(yīng)面曲線走勢(shì)越平滑,表明影響越小。等高線呈橢圓形,表明兩因素之間有較顯著的交互作用;如果等高線呈圓形,則表明兩因素之間的交互作用不顯著[19-21]。結(jié)果表明:溫度(A)和接種量(C)交互作用對(duì)響應(yīng)面值的影響顯著,溫度(A)和初始pH(B)、初始pH(B)和接種量(C)交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。

圖10 溫度、pH、接種量交互作用對(duì)酶活力影響的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between temperature,pH and inoculum on enzyme activity

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6分析得到影響酶活力的最佳條件理論值為溫度36.88 ℃,初始pH為7.25,接種量為2.96%,理論最高酶活力可高達(dá)114400 U/mL。考慮實(shí)際操作,調(diào)整最佳條件為溫度37 ℃,pH為7.3,接種量3%,經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn),測(cè)得β-內(nèi)酰胺酶的平均酶活為(113278.7±1133.4) U/mL,這兩個(gè)結(jié)果之間的良好相關(guān)性證實(shí)了響應(yīng)模型的有效性,表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳條件準(zhǔn)確可靠。在優(yōu)化之前的條件下:葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、NaCl 4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 4 g/L、發(fā)酵溫度37 ℃、pH為7.5、接種量3%、裝液量50 mL/250 mL,該菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的酶活力為88792.7 U/mL,優(yōu)化之后酶活力為優(yōu)化之前酶活力的1.28倍,氮源的改變顯著地提高了酶活,說(shuō)明酵母浸粉更有利于該菌株產(chǎn)酶,其他培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件的改變也有效地提升了該菌株產(chǎn)酶能力。

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出溫度、pH、接種量三個(gè)顯著因素,再用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定最優(yōu)產(chǎn)酶發(fā)酵條件。結(jié)果表明,最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、K2HPO4·3H2O 4 g/L,最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度37 ℃、pH為7.3、接種量3%、裝液量50 mL/250 mL。在此優(yōu)化條件下,該菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的酶活力為113278.7 U/mL,為優(yōu)化之前酶活力(88792.7 U/mL)的1.28 倍。本研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的發(fā)酵條件,顯著提高了產(chǎn)酶水平,為工業(yè)上生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶及其應(yīng)用提供參考依據(jù),為今后建立工程菌穩(wěn)定的發(fā)酵工藝和規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。