結合PRiME HLB凈化快速測定動物源性食品中二硝托胺殘留的超高效液相色譜-串聯質譜法

龐李艷，鐘名琴，吳雯娟*，黃 婷，譚 磊

（1.深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監督管理局食用農產品監管重點實驗室，廣東 深圳 518000）

二硝托胺，又名球痢靈，是20 世紀60 年代法國Dow 公司研發的一種化學合成類抗球蟲藥[1-2]。于1989 年在我國批準使用，主要作用于預防和治療肉雞和蛋雞盲腸和小腸球蟲病（產蛋期禁用）。因其高效、低毒、代謝速度快、抗藥性小、性能穩定等特點被普遍使用[3]。二硝托胺可降低球蟲卵囊檢出率和肉雞死亡率，增強免疫力，提高飼料轉化率和生長性能等[4-5]。然而，長時間過高濃度使用反而會導致雞生長速度緩慢、產蛋停止、共濟失調、抑郁、飼料轉化率低等癥狀，造成的藥物殘留也將導致環境和人體健康的潛在危害[6]。為保障動物源性食品的食用安全，國內外制定了相應的最大殘留限量（MRLs）。日本和歐盟明確雞肉中二硝托胺的 MRLs 為 0.1 μg·kg-1，我國農業部235 號公告對二硝托胺的MRLs 也作出了相應規定。目前，有關二硝托胺的檢測方法主要有凱氏定氮法、薄層層析法、剩余量回滴法、分光光度法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法等[2,7-12]。其中HPLC-MS/MS法靈敏度高、選擇性強，適用于復雜基質中二硝托胺殘留的確證分析[13]。進出口動物源性食品中二硝托胺殘留量的測定液色譜-質譜法（SN_T 2453-2010）是動物組織中二硝托胺的唯一檢測標準，該方法前處理復雜、檢測效率低。肉類樣品基質復雜，蛋白質、脂肪及磷脂等干擾物多[14]。Oasis PRiME HLB 是種增強型新型反相SPE 吸附劑，具有特殊設計的篩板、填料及生產工藝，能有效降低質譜分析中磷脂等非極性干擾物產生的基質效應，凈化效果優于正己烷，且無需活化平衡[15-17]。其樣品前處理過程簡單、快速、方便，數據穩定可靠，還可延長色譜柱壽命、減少儀器維護成本。本研究基于Oasis PRiME HLB 一步式凈化法，建立動物源性食品中二硝托胺殘留的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Aglient 1290 超高效液相色譜儀（美國Aglient公司）；AB Sciex Triple QuadTM5500 質譜儀（美國AB Sciex 公司），配有電噴霧（ESI）離子源；NEVAP-112 型全自動氮吹儀（美國Organomation）；MTV-100 多管渦旋混合儀（杭州奧盛儀器有限公司）；梅特勒PL602E 型天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Sigma 3-18KS 離心機（德國Sigma）；一級水由Milli-Q Integral 3 型超純水儀（法國Milli-Q）制取；奧特賽恩斯AS 系列超聲波清洗機（奧特賽恩斯儀器有限公司）；Waters Oasis PRiME HLB（規格：6cc 200 mg）固相萃取柱（美國Waters公司）。

二硝托胺（Dinitolmide，CAS：148-01-6）標準物質為德國Dr.Ehrenstorfer 公司產品，其純度高于97.0%。甲醇、乙腈、甲酸等有機試劑均色譜純，購自德國Merck。

1.2 提取液的制備

準確量取乙腈800 mL，加入純水200 mL 制得乙腈水溶液（80+20，V1+V2），再加入甲酸2 mL，超聲10 min，得0.2%甲酸-乙腈水溶液（0.2+80+20，V1+V2+V3）。

1.3 標準儲備液和標準工作液的配制

準確稱取二硝托胺標準物質，用乙腈溶解并稀釋成濃度為1.00 mg·mL-1的標準儲備液，于4 ℃下避光保存，保存期為6個月。需要時，再準確移取適量標準儲備液用乙腈逐級稀釋成適當濃度的標準工作液，現配現用。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取

準確稱取經充分絞碎且均質的新鮮雞肉組織2.5 g（精確至0.01 g）于50.0 mL 離心管中，加入0.2%甲酸-乙腈水溶液10 mL，水平振蕩器上渦旋振蕩1 min后，超聲提取5 min。于高速冷凍離心機8 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。

1.4.2 凈化

取4.0 mL 上清液以1 滴·s-1的流速直接過上述Waters Oasis PRiME HLB 固相萃取柱，并將全部流出液收集于干凈的玻璃小管中。準確移取上述流出物2.5 mL于15 mL帶刻度離心管中，40 ℃水浴下氮吹至液體體積少于0.5 mL，用甲酸-甲醇水溶液（甲酸：甲醇：水=0.09：10：90，V1：V2：V3）定容至1.0 mL，混勻。復溶液過0.22 μm 微孔濾膜，供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流動相A為純水；流動相B為甲醇（色譜純）；柱溫40.0 ℃；進樣體積5.0 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測（MRM）；電噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：550 ℃；霧化器壓力：55.0 psi；輔助加熱器壓力：55.0 psi；氣簾氣壓力：35.0 psi；碰撞氣壓力：9 psi。保留時間、定性/定量離子對、碰撞能量及去簇電壓見表2。空白基質及空白基質中添加二硝托胺藥物5.00 μg·kg-1的液相色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

表2 質譜參數

圖1 空白基質及空白基質中添加5.00 μg·kg-1二硝托胺的色譜

2 結果與討論

2.1 線性關系

在空白基質樣品中分別加入2.50、5.00、25.0、50.0、250 μg·kg-1一系列濃度的空白添加試樣，在上述優化后的實驗條件下進行提取、凈化和濃縮，待儀器穩定后依次進樣分析，以目標物峰面積 A 為縱坐標、目標物濃度 X（μg·kg-1）為橫坐標，制得基質加標工作曲線。二硝托胺在2.50～250 μg·kg-1范圍內的線性關系良好，且相關系數R≥0.997。二硝托胺標準曲線的線性參數見表3。

由于電噴霧離子源（ESI）易受樣品基質的影響，該方法通過空白基質加標制作工作曲線的方式可有效克服基質效應對測定結果準確性帶來的影響，在一定程度上可消除試驗過程中的系統誤差。

2.2 方法檢出限與定量限確定

采用在空白基質中做二硝托胺添加水平為5.00 μg·kg-1的 7 平行陽性添加試驗，按照 1.4 方法進行前處理，上機測得二硝托胺的含量分別為4.734、 4.490、 4.270、 4.144、 4.569、 4.211 和4.289 μg·kg-1。計算得樣本中二硝托胺含量的平均值 -X為4.39 μg·kg-1，標準偏差Sb為0.215。根據公式（LOD/LOQ）=（k×Sb×C）/-X（k為置信因子，一般檢出限（LOD）取3，定量限（LOQ）取10；C 為添加濃度水平，μg·kg-1）計算得，LOD和LOQ分別為0.735和2.45 μg·kg-1，見表3。

2.3 方法回收率和精密度驗證

在空白雞肉樣品中分別添加低、中、高3個不同水平的標準工作溶液，每個水平6個平行，在優化的實驗條件下進行目標化合物的回收率試驗，樣液經超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。其回收率和相對標準偏差結果見表4。可見，該方法的回收率較高，5.00、10.0、50.0 μg·kg-1添加水平的回收率范圍分別為82.8%～94.6%、87.1%～94.0%、90.0%～99.2%，均符合相關要求。而且該方法操作簡單，檢出限低、重復性好，結果準確可靠，峰形穩定，能滿足殘留分析的要求，適用于動物源性食品中二硝托胺的檢測分析。

表3 標準曲線線性參數

表4 方法加標回收率和相對標準偏差（n=6）

3 結 論

本方法以Oasis PRiME HLB固相萃取柱“上樣-洗脫”2 步法凈化，建立了動物源性食品中二硝托胺殘留的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法。結果顯示，該方法操作簡單、快捷，方法檢出限低、回收率高、靈敏度好。能有效去除復雜肉類樣品中蛋白質、油脂等引起的基質干擾，延長色譜柱的使用壽命，降低對質譜儀的污染，適用于動物源性食品中二硝托胺的準確定性、定量檢測。