氧化應激介導NLRP3炎性反應小體對慢性阻塞性肺疾病的影響研究

劉 萍 婁 可 文 隆 李 慧 湯渝玲

(長沙市第一醫院呼吸內科，長沙 410035)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 是以持續氣流受限為特征的疾病，氣流受限呈進行性發展，與氣道和肺對有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應增強有關。COPD的發病機制尚不明確，目前認為氧化應激在COPD的發生、發展中起重要作用。

核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白 3(nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3)炎性反應小體功能失調是慢性氣道疾病、肺纖維化等多種呼吸系統疾病的關鍵調控因素。NLRP3炎性反應小體激活的相關分子機制十分復雜，研究[1]顯示活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產生增多，并通過ROS依賴的信號通路可以促進NLRP3炎性反應小體的聚集及活化。本研究擬觀察氧化應激和NLRP3炎性反應小體在COPD患者不同狀態下的變化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2018年6月于長沙市第一醫院住院的COPD患者90例。其中慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)患者60例，男性34例，女性26例，年齡(68.15±7.12)歲。其中AECOPD組患者根據肺功能結果，將AECOPD組分為兩組：(1)重-極重組30例，男性18例，女性12例，平均年齡(70.23±6.56)歲。(2)輕-中組30例，男性13例，女性17例，平均年齡(69.25±5.06)歲。急性加重期患者經治療癥狀體征好轉達到緩解期水平后作為COPD穩定期組，共30例，男性19例，女性11例，平均年齡(71.53.15±4.16)歲。

納入標準：(1)COPD 診斷符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南 (2017 年修訂版)》[1]標準;(2)近 1 個月內無糖皮質激素等藥物治療 ;(3)意識清楚，無認知障礙。排除標準：(1) 合并肺癌、肺結核、支氣管哮喘、支氣管擴張、氣胸、肺膿腫等肺部疾病者;(2) 合并心力衰竭者;(3)多發肺大泡、咯血、近期胸腹手術等不宜行肺功能檢查患者；(4)長期接受糖皮質激素治療者。

選取同期門診健康體檢者共30例作為對照組，平均年齡(67.16±3.08)歲。胸部影像學檢查和肺功能檢查正常，肝、腎功能正常，排除慢性呼吸系統疾病、心血管系統疾病、內分泌系統疾病、神經系統疾病、結締組織疾病等，近4周無呼吸道感染史。本研究經長沙市第一醫院倫理委員會審核批準，受試者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

352 型酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan公司)，AC-8洗板機(芬蘭Thermo Labsystems公司)，TG16W離心機(中國武漢華聯科生物技術有限公司)，HP-Deskjet 3748肺功能儀(德國耶格公司)，PIKO REAL 96熒光定量RCP儀(美國Thermo公司)。 磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer saline，PBS)(北京中杉金橋生物技術有限公司)，人淋巴細胞分離液(中國Solarbio公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，Tris(美國Sigma公司)，UltraSYBR Mixture(中國北京康為世紀公司)，EDTA(美國Sigma公司)，DEPC(美國Sigma公司)，E.B.(美國Sigma公司)，反轉錄-聚合酶鏈反應 (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 試劑盒購自日本TakaRa公司(上海生工生物公司合成所需引物)，聚合酶鏈反應 (transcription-polymerase chain reaction，PCR) 所需試劑由美國 Invitrogen 公司提供，酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 試劑盒購自武漢華聯科生物技術有限公司。

1.2.2 血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)、氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)濃度

采集所有受試者清晨空腹外周血5 mL，轉速設置為3 000 r/min，離心10 min，取上層清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，顯色后在352 型酶標儀下450 nm波長下依序測量各孔的吸光度(A)值，根據A值作出標準曲線，并計算樣本濃度。

1.2.3 標本采集與人外周血淋巴細胞分離

(1)采用含有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA) 的真空采血管，將受試者清晨空腹外周血5 mL置于其中，放置于4 ℃溫度下保存；(2)在離心管中加入3 mL分離液，將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰；(3)室溫，水平轉子1 000g，離心20 min；(4)離心后會出現分層：從上至下依次為稀釋的血漿層、白膜樣的淋巴細胞層、透明的分離液層、紅細胞與粒細胞層。(5)緩慢地將白膜層細胞吸取到15 mL潔凈的離心管中，使用10 mL PBS洗滌白膜層細胞。250g，離心10 min；(6)棄上清，5 mL的PBS或細胞清洗液重懸細胞，250 g，離心10 min。 此步驟重復兩次；(7)棄上清，細胞重懸備用。

1.2.4 RNA 提取及RT-PCR

(1)用Trizol法提取細胞總RNA，向細胞中加入1 mL Trizol充分吹打，混勻后室溫裂解3 min。加入0.2倍體積的三氯甲烷，振蕩，室溫靜置3～5 min；在4 ℃下，12 000 r/min離心15 min。取上層液相，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min；12 000 r/min在4 ℃下離心10 min，去上清，沉淀中加入1 mL 75%(體積分數)乙醇，震蕩儀器；12 000 r/min在4 ℃下離心5 min，去上清，在空氣中干燥5～10 min；加入30～50 μL無菌DEPC處理水溶解，去除沉淀；用紫外分光光度計測定濃度，吸取2 μL RNA溶液于石英比色皿中，用無酶水定容至100 μL，在260 nm與280 nm波長下測其吸光度值，并計算其濃度跟純度。(2)RT-PCR采用SYBR法，反應體系20 μL/孔，包括dNTP混合液，2.5 mmol/L 4 μL、混合引物2 μL、RNA 模板 3 μL、5倍反轉錄緩沖液 4 μL、雙蒸水 0.1 mol/L 2 μL、HiFiScript反轉錄酶 1 μL、無酶水 4 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min進入主循環，其中95 ℃預變性 15 s，60 ℃變性60 s，經40個 循環; 記錄循環次數(CT值)，并計算NLRP3 mRNA表達量。NLRP3正向引物序列為5′-CCGCCATGTACTACCTGCT-3′，反向引物序列為 5′-ACCCCTTTTCGAATTTGCCAT-3′，擴增長度為 212 bp。

1.2.5 肺功能測定

AECOPD患者在癥狀體征緩解達到緩解期水平后行肺功能檢測。所有受試者行肺功能檢測前均需停用短效支氣管擴張劑12 h以上，長效支氣管擴張劑24 h以上。檢測指標包括1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in the first second，FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、一秒率(FEV1/FVC)、FEV1占預計值百分比(forced expiratory volume in the first second % pred，FEV1 %)，測量3次取平均值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 血清中MDA、SOD濃度,NLRP3 mRNA表達量比較

血清中MDA濃度AECOPD組高于COPD穩定期組、COPD穩定期組高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；血清中SOD濃度AECOPD組低于COPD穩定期組、COPD穩定期組低于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；外周血淋巴細胞中NLRP3 mRNA表達量AECOPD組高于COPD穩定期組、COPD穩定期組高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

AECOPD血清中MDA濃度重-極重組高于輕-中組、輕-中組高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；AECOPD血清中SOD濃度重-極重組低于輕-中組、輕-中組低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；AECOPD外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA表達量重-極重組高于輕-中組、輕-中組高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表1 AECOPD組、COPD穩定期組、對照組血清中MDA和SOD濃度和NLRP3 mRNA表達量

Group Number of caseMDA/(ng·mL-1)SOD/(nmol·L-1)NLRP3Control30651.73±50.721 423.45±72.36 1.08±0.19AECOPD60861.32±51.22?# 1 160.20±110.15?# 9.46±3.26?#COPD stable period30796.50±65.83? 1 377.81±85.49? 4.67±0.41?F 144.8795.56137.78P 0.0000.0000.000

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsCOPD stable period group.AECOPD：acute chronic obstructive pulmonary disease;COPD：chronic obstructive pulmonary disease；MDA： malondialdehyde;SOD： superoxide dismutase;NLRP3：nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3.

表2 AECOPD肺功能重-極重組、輕-中組和健康對照組的MDA、SOD濃度和NLRP3 mRNA表達量

Group Number of caseMDA/(ng·mL-1)SOD/(nmol·L-1)NLRP3Control30651.73±50.721 377.81±85.491.078±0.20Weight-very restructuring30898.20±22.50?#1 053.82±14.29?#12.50±1.14?#Light-medium30824.45±44.91?1 266.59±32.64?6.41±1.10?F 282.648284.3471 158.859P 0.0000.0000.000

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vslight-medium group.AECOPD：acute chronic obstructive pulmonary disease;MDA： malondialdehyde；SOD： superoxide dismutase;NLRP3：nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3.

2.2 COPD患者血清中MDA和SOD濃度、外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA表達量、FEV1% pred之間的相關性

Pearson 相關性分析結果顯示，COPD患者血清MDA濃度與NLRP3 mRNA 表達量呈正相關(r=0.64,P<0.05)；COPD患者中血清SOD濃度與NLRP3 mRNA 表達量呈負相關(r=0.90,P<0.05)；COPD患者FEV1%pred與NLRP3 mRNA 表達量呈負相關數(r=-0.78,P<0.05)。

3 討論

COPD的發病機制尚不明確，目前認為氧化應激在COPD的發生和發展中起重要作用。機體遭受到各種外界有害刺激時，體內高活性分子如ROS和活性氮自由基產生過多，氧化程度的速度超過了氧化物的自然代謝速度，導致體內的氧化系統與抗氧化系統失衡，從而引發組織損傷。

研究[2-4]顯示，NLRP3炎性反應小體在氣道慢性炎性反應發病機制中發揮重要作用。COPD患者氣道和肺部許多內源性NLRP3激活劑濃度升高。NLRP3炎性反應小體屬于胞質型模式識別受體[2]，它是主要的固有免疫感受器[3]。機體接受外源性或內源性刺激時，病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)及損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns)促進細胞內ROS產生增多，并通過ROS依賴的信號通路促進NLRP3炎性反應小體的聚集及活化[4]。一旦NLRP3激活，將與ASC相結合，進一步募集pro-caspase-1，并誘導pro-caspase-1進行自我剪切生成活化的caspase-1?；罨腸aspase-1促進促炎細胞因子IL-1β和 IL-18的剪切成熟和分泌，從而激活下游的炎性反應。

NLRP3炎性反應小體功能失調是慢性氣道疾病、肺纖維化等多種呼吸系統疾病的關鍵調控因素[5-8]。NLRP3炎性反應小體激活的相關分子機制十分復雜，近年研究[9-12]顯示，ROS產生增多，并通過ROS依賴的信號通路可能促進NLRP3炎性反應小體的聚集及活化，NLRP3炎性反應小體的聚集及活化引起肺部及全身炎性反應，對慢性阻塞性肺疾病進程產生影響。

本研究中，血清MDA濃度AECOPD組高于COPD穩定期組、COPD穩定期組高于對照組(P<0.05)；血清SOD濃度AECOPD組低于COPD穩定期組、COPD穩定期組低于對照組(P<0.05)。這與Bartoli等[5]的研究結果一致,這提示體內氧化與抗氧化失衡刺激黏液高分泌、炎性反應因子激活和血漿滲出增加，形成慢性阻塞性肺疾病。AECOPD重-極重組MDA濃度高于輕-中組，差異有統計學意義(P<0.05)。AECOPD重-極重組SOD濃度低于輕-中組，差異有統計學意義(P<0.05)。這與Keranis等[13]的研究結果一致,這提示體內氧化應激增強可能對慢性阻塞性肺疾病患者的肺功能產生影響，從而影響慢性阻塞性肺疾病的疾病嚴重程度。

AECOPD組、COPD穩定期中的NLRP3 mRNA表達量均高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；AECOPD組患者的NLRP3 mRNA表達量高于COPD穩定期患者，差異有統計學意義(P<0.05)。在COPD患者中NLRP3 mRNA表達量增高，這與毛建等[14]的研究結果一致。由此筆者推測，AECOPD組和COPD穩定期患者中NLRP3 mRNA表達量的差異可能與病原微生物感染引發體內炎性反應嚴重程度有關。

AECOPD重-極重組患者的NLRP3 mRNA表達量高于輕-中組患者，差異有統計學意義(P<0.05)。AECOPD肺功能重-極重組患者比輕-中組患者多存在反復長期住院、免疫功能低下等情況，而呼吸道病原菌的定植及二重感染的發生可能與患者長期使用抗生素、免疫功能低下有關。外源性病原菌可通過PAMPs刺激淋巴細胞、巨噬細胞等炎性反應細胞，NLRP3炎性反應小體被激活，肺部炎性反應加重[15-16]。

COPD患者血清中MDA濃度升高，NLRP3 mRNA表達量升高，MDA濃度與NLRP3 mRNA表達量呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)。COPD患者血清中SOD濃度降低，NLRP3 mRNA表達量升高，SOD濃度與NLRP3 mRNA表達量呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)。COPD患者FEV1%下降，NLRP3 mRNA表達量升高，FEV1% pred與NLRP3 mRNA表達量呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)。機體遭受各種有害刺激時體內出現氧化系統與抗氧化系統失衡，ROS產生增多，并通過ROS依賴的信號通路促進NLRP3炎性反應小體的聚集及活化，從而對COPD的疾病進程產生影響[17-19]。

綜上所述，機體遭受各種有害刺激時，出現氧化系統與抗氧化系統失衡，細胞內ROS活化，ROS依賴的信號通路促進NLRP3炎性反應小體的聚集及活化，體內炎性反應加重，從而加重COPD病情。但本組研究對象多為中老年患者，且樣本量較小，結果及結論可能仍存在一定局限性，而氧化應激介導NLRP3炎性反應小體活化對COPD患者肺功能的影響的具體機制仍有待進一步深入研究。