血管生成素樣蛋白4在非酒精性脂肪肝診斷中的應用效果分析

楊龍艷 王 巖 許月超 程雅楠 馬 燕 趙 冬

(首都醫科大學附屬北京潞河醫院內分泌代謝與免疫性疾病中心 糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京 101149)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損傷因素所致的肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的臨床病理綜合征。隨病程的進展而表現為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化[1]。近年來NAFLD的發病率呈明顯的上升趨勢，一項Meta分析結果[2]顯示，全球NAFLD的發病率為25%，其中高達59%會進展為脂肪性肝炎。NAFLD可直接導致失代償期肝硬化、肝細胞癌，還可參與2型糖尿病和動脈粥樣硬化的發病，嚴重危害人類健康[3]。目前對于NAFLD的診斷金標準是有創的肝組織活檢，對于無創的評估方法包括超聲、核磁共振等，都存在一定局限性。所以探索NAFLD的血清學標志物至關重要。血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like 4，ANGPTL4)在肝臟、脂肪、巨噬細胞中合成，分泌入血后，抑制脂蛋白脂酶活性，參與脂代謝的調節[4]。本研究采用臨床病例對照研究，探討ANGPTL4與NAFLD及嚴重程度的關系，分析ANGPTL4作為NAFLD潛在的血清分子標志物的可能性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至12月在首都醫科大學附屬北京潞河醫院內分泌代謝與免疫性疾病中心診斷為NAFLD的52例患者為病例組(NAFLD組)，同期選取47例健康者為對照組。所有研究對象都由同一名超聲科醫生進行腹部超聲檢查，并將NAFLD患者分為輕度、中度和重度。納入標準為：年齡30～50歲；不過量飲酒(男性：飲酒量<30 g/d，女性：飲酒量<20 g/d)。排除標準：糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)、腦血管病、慢性肝病、服用降脂藥或其他藥物的患者。

1.2 研究方法

(1)臨床檢測：測量身高、體質量并計算體質量指數(body mass index, BMI)。檢查前，受試者從22∶00禁食，并在第二天早上7∶00～8∶00抽取靜脈血樣本。血液分析包括丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate amino transferase,AST)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-glutamyltransferase, GGT)、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)。低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。血清樣本分裝并儲存在-80 ℃冰箱。

(2)ANGPTL4檢測：采用酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法檢測血清ANGPTL4濃度，人血清ANGPTL4的ELISA試劑盒購于日本Immuno-Biological Laboratories公司。

(3)NAFLD診斷：所有受試者都接受了腹部超聲檢查，由同一名超聲醫生進行操作和實施。超聲檢查均采用HITACHI Preirus彩超診斷儀(日本日立公司)，探頭頻率1-5 MHz，觀察肝臟大小、形態、包膜、肝實質回聲、肝內血管結構等。NAFLD超聲診斷分級標準：①輕度：肝實質回聲彌漫性改變，稍細密、增強；后方回聲無衰減，包膜清晰；肝臟內管狀結構清晰可見。②中度：肝實質回聲彌漫性改變，細密、增強；后方回聲有衰減，包膜欠清晰；肝臟內管狀結構欠清晰。③重度：肝實質回聲彌漫性改變，顯著細密、增強；后方回聲衰減明顯，包膜不清或者不可見；肝臟內管狀結構不清或者不可見。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 2組基本特征比較

NAFLD組的年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、ALT、AST和TC與對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。2組GGT、TG、HDL-C和LDL-C指標比較，差異無統計學意義(p>0.05)，詳見表1。

2.2 各組間血清ANGPTL4濃度比較

為了分析ANGPTL4在NAFLD進展中的作用，將52例NAFLD患者分為輕度NAFLD(28例)和中重度NAFLD (24例)。結果顯示，隨著NAFLD嚴重程度的升高，血清ANGPTL4濃度逐漸升高(F=4.553，P=0.0354)。提示ANGPTL4與NAFLD的發生和進展有關，詳見表2。

2.3 ANGPTL4用于NAFLD評價的效果分析

ANGPTL4的ROC曲線下面積為0.638(95%CI：0.526～0.750)，表明ANGPTL4有一定識別NAFLD的能力。最大約登指數對應的ANGPTL4濃度為90.93 ng/mL，以此作為診斷NAFLD的臨界值。診斷結果與超聲診斷結果的比較詳見表3。雖然診斷的靈敏度為100%，但特異度較低，一致性中等，可用于臨床的輔助診斷，但應注意誤診率。

表1 NAFLD組與對照組基本特征比較

ItemNon-NAFLD(n=47)NAFLD(n=52)tPAge/a42.83±4.6637.52±4.485.700.000BMI/(kg·m-2)23.32±3.4027.69±3.33-8.000.000Systolic blood pressure/mmHg△115.9±15.6126.4±14.4-3.280.001Diastolic blood pressure/mmHg△70.35±9.7279.84±11.11-4.360.000ALT/(U·L-1)20.17±13.3541.79±31.03-4.780.000AST/(U·L-1)18.00±4.9723.38±11.85-3.080.003GGT/(U·L-1)27.65±31.3438.87±24.76-1.870.066TC/(mmol·L-1)1.17±0.702.40±1.33-5.680.000TG/(mmol·L-1)4.89±0.974.88±0.99-0.150.883HDL-C/(mmol·L-1)1.48±0.321.37±0.511.200.235LDL-C/(mmol·L-1)2.94±0.772.80±0.960.600.550

△1 mmHg=0.133 kPa;NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease;BMI: body mass index;ALT:alanine aminotransferase;AST:aspartatea aminotransferase;GGT:γ-glutamyltransferase;TG:triglyceride;TC:total cholesterol;LDL-C: low density lipoprotein cholesterol;HDL-C: high density lipoprotein cholesterol.

表2 各組間血清ANGPTL4濃度比較

NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease;ANGPTL4:angiopoietin-like 4.

表3 ANGPTL4用于NAFLD診斷的效果評價

Sensitivity=100%，Specificity=46.8%，Kappa=0.48;NAFLD:non-alcoholic fatty liver disease;ANGPTL4:angiopoietin-like 4.

3 討論

NAFLD是常見的一種慢性肝臟疾病，患病率逐年上升，目前已成為除病毒性乙型肝炎以外的又一嚴重影響肝臟功能的重大肝臟疾病。NAFLD患者多數沒有明顯的臨床癥狀和表現，多數因為體檢而被發現。NAFLD早期進行干預或者治療是能夠逆轉的。NAFLD早期沒有及時發現并進行有效的干預治療，就會進展為非酒精性脂肪性肝炎甚至是肝硬化、肝癌，所以NAFLD的早期診斷和治療至關重要。目前肝活檢仍是診斷NAFLD的金標準。然而，肝活檢是一種侵入性的方法，而NAFLD發病率很高，用肝活檢來篩查NAFLD顯然是不可行的。各種血液標志物檢測用于評估NAFLD的嚴重程度，目前纖維化試驗，如BARD評分、NAFLD纖維化評分和Fibrosis-4指數，對晚期纖維化的診斷是有用，而不適于輕度NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(nonalco-hoic steatohepatitis, NASH)[5-8]。雖然在某些臨床情況下，NAFLD患者會出現血清ALT和AST的升高，但是這些肝酶指標并不能特異性識別NAFLD并反映其嚴重程度。其他血清生物標志物如細胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、白細胞介素-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA)、CXC趨化因子配體10[chemokine (C-X-C motif) ligand 10, CXCL10]、人纖溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI1)、脂肪因子和成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21, FGF21)被認為可能作為NAFLD嚴重程度的非侵入性指標，但都尚未被證明是臨床有效[9]。所以本研究探索NAFLD的血清學新的診斷標志物，為NAFLD的早期診斷和區分嚴重程度提供新思路。

ANGPTL4屬于類血管生成素樣蛋白家族成員，分泌入血后，它被分解為N-末端片段(含有抑制脂蛋白酯酶活性區，可形成低聚物)和C-末端片段(含有纖維蛋白原樣結構，保持單聚體狀態)[10]。ANGPTL4通過抑制脂蛋白脂肪酶二聚體形成，而抑制脂蛋白脂肪酶的活性[11]。過表達ANGPTL4小鼠表現為高三酰甘油血癥；相反，在ANGPTL4敲除的小鼠，其三酰甘油下降65%～90%，極低密度脂蛋白膽固醇濃度下降，且伴有脂蛋白酯酶活性升高[12]。ANGPTL4在脂質代謝中起到重要的作用。然而，血清ANGPTL4濃度與NAFLD之間的關系尚不清楚。

本研究結果提示，與非NAFLD對照相比，NAFLD患者血清ANGPTL4濃度明顯升高，并隨著NAFLD分級而升高(F=4.553，P=0.0354)。ANGPTL4的ROC曲線下面積為0.638，表明ANGPTL4有一定識別NAFLD的能力。血清ANGPTL4診斷結果與超聲診斷結果比較，靈敏度=100%，特異度=46.8%，Kappa=0.48。以上研究結果提示ANGPTL4在NAFLD的發生和進展中起到重要作用，并對NAFLD的診斷具有一定的預測作用。以往動物實驗中研究[13]顯示腺病毒介導的ANGPTL4過表達可降低血糖并誘發C57小鼠的高脂血癥、肝腫大和脂肪肝。ANGPTL4增加了脂肪酸合成酶和硬脂酰輔酶A脫水解酶等幾種關鍵產脂酶的表達，使底物從糖異生轉為脂肪生成，進而導致血糖濃度降低和肝臟TG含量增加[13]。鑒于ANGPTL4對糖代謝也有調控作用，所以本研究排除了糖尿病患者，單純研究ANGPTL4對NAFLD的作用。2019年5月的最新研究[14]顯示：地塞米松處理野生型小鼠顯著增加血漿三酰甘油濃度，而地塞米松處理ANGPTL4敲除小鼠，血漿三酰甘油濃度無明顯變化。說明ANGPTL4作為糖皮質激素的靶基因，是長期或者過量糖皮質激素暴露導致脂質紊亂包括高三酰甘油血癥和脂肪肝所必需的。以上動物研究結果和本研究的結論一致，ANGPTL4在NAFLD的發生發展中起到重要的作用。

綜上所述，NAFLD的早期診斷和及時干預治療可以逆轉早期NAFLD。所以探索NAFLD血清預測因子具有非常重要的意義，本研究顯示，與對照組相比，NAFLD患者血清ANGPTL4濃度升高，并隨著NAFLD的嚴重程度而逐漸升高。ANGPTL4對NAFLD患者具有一定的預測診斷能力。所以血清ANGPTL4濃度可能成為NAFLD以及嚴重程度的一個新的血清學預測指標。