梔子苷對睡眠剝奪大鼠學習記憶的影響

曹 靜 汪萌芽

睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指各種因素所致的睡眠減少和睡眠時間嚴重不足，是由于自身生理、病理因素或環境的影響而影響了生理所需睡眠量的狀態[1]。研究[2]顯示，SD后人們出現學習記憶能力下降現象。梔子苷(geniposide)是從梔子的干燥成熟果實中提取制成的環烯醚萜苷類化合物，是梔子中發揮藥效作用的主要成分[3]。有研究[4]表明，梔子苷能改善生物睡眠。但有關梔子苷對生物行為和認知影響的研究鮮有報道。為此，本研究通過建立SD大鼠模型，并給予不同劑量梔子苷干預，以期了解梔子苷對SD大鼠學習記憶的影響，為臨床SD患者學習記憶的改善提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇SPF級雄性Sprague -Dawley大鼠50只，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場,動物許可證號：SCXK(蘇)2017-0001]，體質量200～250 g，10周齡。所有大鼠飼養條件一致：籠養，每天接受光照12 h,黑暗12 h，光照周期為8:00～20:00。實驗溫度為(20±2)℃，濕度60%，喂以大鼠標準飼料和清潔飲用水，大鼠可自由攝食、攝水。動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。

1.2 設備與藥品 Morris水迷宮水池由本實驗室參照文獻[5]自制；一個自制的不銹鋼可視平臺, 一個采用亞克力材料自制的透明不可視平臺。兩個平臺均為直徑10 cm、高30 cm的圓柱體。梔子苷原料藥(合肥拜爾迪化學科技有限公司，分析標準品≥98%)。

1.3 動物分組、造模與鑒定 將大鼠適應性喂養一周之后稱重，在體質量無差別情況下，利用隨機數字表法分為5組：正常組10只，正常飼養不加任何處理；SD組10只，建立SD模型；梔子苷低劑量組10只，建立SD模型并給予低劑量梔子苷(10 mg/kg)干預；梔子苷中劑量組10只，建立SD模型并給予中劑量梔子苷(20 mg/kg)干預；梔子苷高劑量組10只，建立SD模型并給予高劑量梔子苷(40 mg/kg)干預。除正常組以外，對其他4組大鼠采用輕觸+換籠方法[6]建立SD模型：即每天剝奪大鼠睡眠8 h(上午9點-下午5點)，連續7天，期間每小時換籠1次，每天換籠9次。在此期間，當大鼠出現點頭、協靠、依靠或者打盹等現象時，給予大鼠刺激，用報紙輕輕拍打籠子，但要注意避免與大鼠直接接觸。連續7天后按文獻[7]進行SD模型驗證:大鼠全身皮毛疏松，毛發發黃無光澤，并逐漸出現活動明顯減少，打盹次數增多，對刺激敏感性降低，眼色暗紅，激惹呈回避反應等，甚至同性騎行行為。按余群星[8]報道的方法對5組大鼠進行尋找平臺訓練，結果剔除了不符合實驗條件的大鼠4只，即正常組和梔子苷低、中、高劑量組各一只。

1.4 給藥方法 用藥方法按照武海霞等[9]的研究進行，正常組、SD組分別予以灌胃蒸餾水(0.01 mL/kg)，梔子苷低劑量組灌胃梔子苷稀釋溶液0.01 mg/mL，中劑量組為0.02 mg/mL，高劑量組為0.04 mg/mL，灌胃劑量均為0.01 mL/g。

1.5 觀察指標 梔子苷干預一周后，采用Morris 水迷宮測試5組大鼠第1天至第7天逃避潛伏期、穿越平臺次數及第一次到達原平臺時間。

1.5.1 水迷宮建立 參照文獻[5]自制Morris水迷宮水池，即直徑120 cm高 50 cm的不銹鋼圓形水池, 十字均分為4個虛擬象限，2個平臺可置于同一任意一個象限中央。

1.5.2 逃避潛伏期檢測 按余群星[8]報道的方法進行逃避潛伏期檢測。將5組大鼠從4個象限的任一象限面向池壁放入水中，每個象限測試一次，若大鼠能找到并登上平臺，在平臺上停留5 s后則停止記錄，記錄的大鼠找到平臺在水中消耗的時間記為逃避潛伏期；若大鼠60 s內未找到平臺，則停止計時后由實驗者引導其登上平臺并停留15 s，此時的逃避潛伏期計為60 s。連續檢測7天。逃避潛伏期長表示大鼠學習能力降低。

1.5.3 穿越平臺次數及第一次到達原平臺時間檢測 連續7天逃避潛伏期檢測結束1 h后, 撤掉平臺,將大鼠從原平臺所在象限的對側象限放入水中，檢測大鼠在60 s內穿過原平臺所在位置的次數(穿越原平臺次數)及第一次到達原平臺的時間。穿越原平臺次數少及第一次到達原平臺的時間長表示大鼠的記憶能力降低。

2 結果

2.1 5組大鼠逃避潛伏期比較 梔子苷干預一周后，5組大鼠第一天至第7天的逃避潛伏期比較，不同時間、組間、組間及時間的交互效應差異均有統計學意義(P<0.05)。因本重復測量資料不滿足球形度檢驗，故采用Greenhouse-Geisser進行檢驗。與正常組大鼠比較，SD組大鼠第一天到第7天逃避潛伏期明顯延長，差異均有統計學意義(P<0.05)。與SD組比較，梔子苷低、中、高劑量組逃避潛伏期縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。梔子苷低劑量組逃避潛伏期長于梔子苷中、高劑量組，梔子苷中劑量組逃避潛伏期長于梔子苷高劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠第一天至第7天逃避潛伏期比較

注：同一時間不同組間的比較，符號(a，b，c，d)完全不同表示P<0.05;與第1天比較，*P<0.05;與第2天比較，P<0.05;與第3天比較，P<0.05;與第4天比較，P<0.05;與第5天比較，P<0.05

2.2 5組大鼠穿越平臺次數及第一次到達原平臺時間的比較 5組穿越平臺次數、第1次抵達原平臺時間的組間差異均有統計學意義(P<0.05)。與正常組比較，SD組大鼠穿越原平臺次數均明顯減少，第1次抵達原平臺時間均明顯延長，差異有統計學意義(P<0.05)；與SD組比較，梔子苷低、中、高劑量組大鼠穿越平臺次數均明顯增多，第1次抵達平臺時間明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。與梔子苷低劑量組比較，梔子苷中、高劑量組穿越平臺次數增多，第一次到達原平臺時間延長；梔子苷中劑量組穿越平臺次數少于梔子苷高劑量組，第一次到達原平臺時間長于梔子苷高劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠穿越平臺次數及第一次到達原平臺時間比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與SD組比較，#P<0.05；與梔子苷低劑量組比較，P<0.05；與梔子苷中劑量組比較，P<0.05

3 討論

睡眠是人類維持正常生命不可或缺的生理活動，一旦發生SD，則會導致機體發生一系列改變，包括生理、心理以及病理、行為學異常等[10]。目前對于SD的治療，多采用鎮靜、催眠作用的精神類藥物，長期服用此類藥物可導致耐藥性，最終影響神經系統功能[11]。而中藥制劑毒性作用低且能標本兼治，既不會成癮，也不會產生依賴性[12]。梔子苷是從梔子的干燥成熟果實中提取，其主要成分為環烯醚萜類化合物。梔子苷能改善生物睡眠[4]，藥理學研究[13-15]表明，梔子苷具有抗老年癡呆功效，可明顯改善學習記憶功能。本研究探討梔子苷對SD大鼠學習記憶的影響，以期為臨床對抗SD人群學習記憶能力下降提供藥物治療依據。

有研究[16]顯示，10周齡雄性SD大鼠的學習記憶能力相對穩定，故本研究選擇此類型大鼠為實驗對象。本組資料顯示，SD組大鼠第1天至第7天的逃避潛伏期長于正常組，SD組大鼠穿越平臺次數少于正常組、第1次抵達原平臺時間長于正常組(P均<0.05)，表明SD大鼠存在學習記憶力下降。此與甘麗[17]的研究結果一致，這可能是與一氧化氮合酶在前額和海馬中的神經元表達水平下降有關。具有神經毒性的一氧化氮合酶在SD后濃度增加，使得應激強度過大，導致神經元損傷[18]。

本研究還發現，與SD組比較，梔子苷低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)。梔子苷低劑量組大鼠逃避潛伏期長于梔子苷中、高劑量組(P<0.05)，說明對SD大鼠進行梔子苷干預后，大鼠學習能力得到了一定程度的改善。與SD組比較，梔子苷低、中、高劑量組大鼠穿越平臺次數均增多(P<0.05)，第一次抵達平臺時間縮短(P<0.05)，且梔子苷劑量越高，大鼠穿越平臺次數越多及第一次抵達平臺時間越短，表明梔子苷干預劑量對SD大鼠記憶能力的改善有影響，劑量相對較高時改善效果更好。此與陳安春等[19]的研究結果較為一致。這可能是SD后可引起大鼠代謝增加、自主神經系統功能紊亂等, 而生物體內一些重要神經遞質如一氧化氮、多巴胺、5-羥色胺、乙酰膽堿、自由基等的改變, 都與學習記憶密切相關[18]。因此SD后學習記憶能力下降可能與SD后腦內神經遞質的改變有關。梔子苷能降低氧化應激傷害，增加腦源性神經營養因子和膠質細胞源性神經營養因子的釋放[20]，起到神經保護作用，從而改善學習記憶[21]。

綜上所述，梔子苷能改善SD大鼠的學習記憶能力，且高劑量組梔子苷可以明顯縮短逃避潛伏期和大鼠尋找平臺的時間，同時也增加SD大鼠的探究行為。由于本研究只進行了行為學觀察，其具體機制有待今后進一步深入研究。