響應面法優化固相酸水解鮑魚臟器多糖工藝

孫 沖,杜阿珠,姚昱錕,陳錦權,方 婷1,,*

(1.閩臺特色海洋食品加工及營養健康教育部工程研究中心,福建福州 350002;2.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

鮑魚(Haliotisdiscushannai)素以名貴著稱,因其高營養價值,一直深受著消費者喜愛[1],但如今大多數食品加工廠對鮑魚的加工只局限于對其肉質的利用,而占鮑魚重量1/4的鮑魚臟器往往被直接丟棄或做飼料處理[2]。鮑魚臟器被人們稱為“鮑魚肝”,含有豐富的蛋白質、多糖、魚油等高活性物質及微量元素[3],直接丟棄會造成資源浪費,鮑魚臟器中的重金屬還會造成環境污染[4]。重金屬含量超標及鮑魚毒素[5]制約鮑魚臟器的利用,因此如何合理地開發利用鮑魚下腳料,將這些廢棄物變廢為寶,創造出更多的經濟效益,受到社會的關注[6]。

已有研究發現鮑魚臟器中含有豐富的多糖類化合物[7],鮑魚因其長期生存在高鹽、低溫缺氧、光照不足的環境中,使得鮑魚多糖往往具有獨特的生物活性,如降血脂[8]、抗氧化[9]、抗凝血[10]、抑菌[11]、抗腫瘤、免疫調節[12]等。但多糖類物質一直受限于粘度大、分子量大、不易散、不利于人體吸收利用[13]等缺點,所以其應用范圍變得很狹窄。多糖降解為寡糖后,會發生分子量降低,結構簡化[14],溶解性增強等變化,同時寡糖較多糖低毒性,因此寡糖一直是研究熱點。寡糖相對分子量小、易于溶解、易被吸收,較其它糖類化合物表現出更為顯著的生物活性,具體表現為抗氧化[15]、抗腫瘤[16]、抗凝血[17]等,因而備受人們的關注,所以確定多糖水解最佳條件就顯得尤為重要。鮑魚臟器寡糖(abalone viscera oligosaccharide,AVO)是由鮑魚臟器多糖(abalone viscera polysaccharide,AVP)降解而來的聚合度較低的低聚糖,目前對鮑魚臟器寡糖的研究少有報道。

本文利用固相酸(732#陽離子交換樹脂)降解多糖,水解條件溫和,且水解過程中不會引入其他雜質,樹脂可以回收利用,并以多糖水解率為指標,結合響應面法(response surface methodology,RSM)優化多糖水解條件,確定了固相酸水解多糖的最佳工藝條件,同時采用葡聚糖凝膠柱層析和紅外光譜分析對降解產物進行了分離純化[18]和結構測定,以期為鮑魚的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮑魚臟器多糖(AVP) 本試驗前期制備并純化[19];硫酸、氫氧化鈉、無水乙醇、95%乙醇、葡萄糖、苯酚(結晶酚)、磷酸、牛血清蛋白、濃鹽酸、氯化鈉 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;732#陽離子交換樹脂 武漢華眾新化工有限公司;氯仿 分析純，杭州高晶精細化工有限公司;正丁醇 分析純,浙江杭州雙林化工試劑廠;考馬斯亮藍G-250 分析純,北京恒業中遠化工有限公司。

LG-1.0真空冷凍干燥機 沈陽航天新陽速凍設備制備有限公司;L-550臺式低速離心機、DD5大容量離心機 長沙湘儀離心機有限公司;JJ600電子天平 常熱市雙杰測試儀器廠;R205旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司;PH SJ-3F pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;UV-6300PC紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;BT-100電腦恒流泵、SBS-100-LCD自動部分收集器、HD421-88紫外檢測儀 上海琪特分析儀器有限公司;HWS28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;DHG-9240A電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;冰箱 西門子公司;VERTEX 70傅里葉紅外光譜儀 德國布魯克BRUKER。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮑魚臟器多糖水解工藝 稱取質量為0.1 g鮑魚臟器多糖,加入100 mL蒸餾水,向其中加入一定質量的732#陽離子交換樹脂,在基礎實驗溫度下反應不同的時間。反應完畢后立即用1 mol/L NaOH溶液調pH至中性,離心(7000 r/min,15 min),除去樹脂及水不溶性殘渣,上清液加入無水乙醇,使最終乙醇體積分數為70%,靜置過夜,離心(7000 r/min,15 min),除去乙醇不溶性殘渣,上清液減壓蒸發近干,冷凍干燥即得鮑魚寡糖[20]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 樹脂用量對多糖水解率的影響 稱取0.1 g鮑魚臟器多糖,加入100 mL蒸餾水,加入質量為10、20、30、40、50、60 g的732#樹脂,按1.2.1中方法在水浴溫度為70 ℃的條件下降解3 h,測定鮑魚臟器多糖水解率。

1.2.2.2 水解時間對多糖水解率的影響 稱取0.1 g鮑魚臟器多糖,加入100 mL蒸餾水,加入質量為30 g的732#陽離子交換樹脂,按1.2.1中方法在水浴溫度為70 ℃的條件下降解1、2、3、4、5 h,測定鮑魚臟器多糖水解率。

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1.2.2.3 水解溫度對多糖水解率的影響 稱取0.1 g鮑魚臟器多糖,加入100 mL蒸餾水,加入質量為30 g的732#陽離子交換樹脂,按1.2.1中方法在水浴溫度分別為50、60、70、80、90 ℃的條件下降解3 h,測定鮑魚臟器多糖水解率。

1.2.3 響應面優化設計 根據單因素實驗的結果,進行響應面試驗。采用Design Expert 8.0.6 數據統計分析軟件對試驗數據進行回歸分析確定數學模型。每一個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進行編碼,該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程,因素水平設計見表1。

表1 實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 還原糖含量測定及水解率計算 本試驗水解后的寡糖混合物中還原糖含量的測定采用DNS法。參考彥繁鶴等對甘蔗中還原糖的測定[21]。測定還原糖的含量后,按下式計算多糖水解率。

1.2.5 寡糖分離 本試驗對所得的鮑魚臟器寡糖進行凝膠層析,選用Sephadex G-25(100 cm×1.5 cm)凝膠層析分離純化鮑魚臟器寡糖,準確稱取一定量的Sephadex G-25,在蒸餾水中進行溶脹,充分溶脹后去除上層懸浮的細小顆粒,把處理好的Sephadex G-25先進行半小時的超聲波清洗器脫氣,保持浸濕狀態,并緩慢倒入層析柱中,待其自然沉降后,用蒸餾水平衡一天。加少量蒸餾水將鮑魚臟器寡糖充分溶解,上層析柱,洗脫劑為蒸餾水,通過恒流泵控制流速為1.0 mL/min,每6 min收集一管,采用苯酚-硫酸法[22]檢測每管在490 nm處的吸收峰,以洗脫管數為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制洗脫曲線。將收集到鮑魚臟器寡糖組分減壓濃縮后冷凍干燥,得到鮑魚臟器寡糖。

1.2.6 紅外光譜分析 稱取樣品2 mg,與200 mg的經過干燥的KBr放在瑪瑙研缽里,研磨混勻,壓片,用傅里葉變換紅外光譜儀在500～4000 cm-1波長區域內進行紅外掃描[23],從而確定糖苷鍵的構型及觀察其他官能團。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 樹脂用量對多糖水解率的影響 圖1為樹脂用量對多糖水解率的影響,由圖1可知,多糖水解率隨樹脂用量先上升再下降,當樹脂用量為40 g時,多糖水解率最高,水解率為77.8%,故最佳樹脂用量為40 g。相比于伍毅等[24]利用鹽酸水解大棗多糖的研究,固相酸水解多糖的水解率變化更加平緩,這表明相比于鹽酸水解多糖,固相酸水解條件更加溫和,且水解過程中不會引入其他雜質,陽離子樹脂可以回收重復使用,更加綠色環保。

圖1 樹脂用量對多糖水解率的影響Fig.1 Effect of resin dosage on thehydrolysis rate of polysaccharide

2.1.2 水解時間對多糖水解率的影響 水解時間對鮑魚臟器多糖水解率有一定影響,由圖2可知,在1～3 h時,多糖水解率呈上升趨勢,多糖水解率在50%～80%之間,當時間長于3 h后,多糖水解率趨于平緩,水解率基本保持在76%,不再發生明顯變化,與牛放等[25對野菊花多糖水解時間的研究一致,表明多糖水解率已經達到最大釋放量,故從能源利用效率考慮,水解最適時間為3 h。

圖2 水解時間對多糖水解率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time onhydrolysis rate of polysaccharide

2.1.3 水解溫度對多糖水解率的影響 由圖3可知,隨著水解溫度上升,多糖水解率增加,在70 ℃時,水解率達到最高,為76%。水解溫度是影響鮑魚臟器多糖水解率的一個重要因素,隨著溫度升高,分子運動加劇,多糖糖苷鍵被酸分子破壞的幾率增加,從而可以提高水解率[26],但隨著溫度的繼續升高多糖水解率開始下降。而野菊花[25]、紫菜[27]、猴頭菇[28]等多糖水解率隨水解溫度上升會趨于平衡,造成這一差異的原因一方面是樹脂達到了其耐受溫度,自身結構遭到破壞,催化降解能力逐漸降低[29];另一方面是水解溫度升高會導致產物中糖發生復分解反應,生成了糠醛等非糖副產物[30],從而使得還原糖含量下降,引起水解率減小,故最佳水解溫度為70 ℃。

圖3 水解溫度對多糖水解率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperatureon hydrolysis rate of polysaccharide

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面分析因素水平的確定 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken的中心組合設計原理,以3個主要因素樹脂用量、水解時間和水解溫度為自變量,以3次試驗所得鮑魚臟器多糖水解率的平均值為響應值(Y)設計三因素三水平的響應面分析試驗,具體的設計與結果如表2。

表2 響應面分析方案與結果Table 2 RSM analysis scheme and results

2.2.2 響應面試驗結果 采用Design Expert 8.0.6 軟件進行統計分析,得到回歸方程:Y=80.69+0.61A+1.91B+2.75C-0.66AB+0.027AC-0.81BC-3.15A2-3.31B2-3.30C2

為了體現回歸方程的有效性及各因素對水解率的影響程度,對二次多元回歸方程進行了方差分析,結果如表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the established native regression model

2.2.4 響應曲面分析 響應曲面圖和等高線圖能夠直觀反應出各因素間交互作用的強弱。響應曲面坡度越陡峭,說明各因素間的交互作用越顯著,響應曲面越平緩,說明各因素的交互作用越弱;等高線為橢圓形時,說明各因素間的交互作用越強,等高線越趨近于圓形時,說明各因素間的交互作用較弱。圖4(a)為樹脂用量和水解時間之間交互作用的結果,當水解溫度一定時,隨著樹脂用量和水解時間的增加,多糖水解率先升高再降低,響應曲面明顯,有明顯的峰值。圖4(b)為樹脂用量和水解溫度之間的交互作用,由圖可知,溫度升高可以增加水解率,但溫度過高會影響樹脂結構和水解產物,多糖水解率下降。圖4(c)為水解時間和水解溫度之間交互作用的效果,從圖中可以看出,多糖水解率隨著兩者的增加先升高再降低,有明顯的最大值。從等高線圖可以直觀看出,各交互項等高線圖近似圓形,說明各因素間交互作用不顯著,與表3中顯著性檢驗結果相吻合。由響應曲面最高點及等高線圖知,在所選范圍內存在峰值即響應曲面最高點,也是等高線圖的中心點。

圖4 各因素交互作用對多糖水解率影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of interactions among different factors on polysaccharide hydrolysis rate

2.2.5 多糖水解率最優值的確定及驗證試驗 利用Design Expert 8.0.6 軟件進行分析確定各因素的最優值為:樹脂用量A=40.26 g,水解時間B=3.14 h,水解溫度C=70.01 ℃,多糖水解率的預測值Y=80.19%。結合實際操作將各因素的最佳值修正為樹脂用量40 g,水解時間3 h,水解溫度70 ℃。在此條件下進行3次平行驗證,最終鮑魚臟器多糖水解率為80.69%,接近且略高于預測值,因此,響應面法優化鮑魚臟器多糖水解條件是可行的。

目前對鮑魚臟器寡糖制備的研究還少有報道。Wu等[31]通過中心復合設計優化利用過氧化氫水解牡蠣多糖制備寡糖,寡糖產量為10.61%;鄧宇峰等[32]采用酶法水解龍須菜瓊膠,多糖水解率為56.6%;和法濤等[28]利用硫酸酸解猴頭菇多糖并通過正交試驗優化,多糖水解率為70.11%。本實驗通過響應面法優化鮑魚臟器多糖水解條件,相比于其它多糖,鮑魚臟器多糖水解率為80.69%,水解率較高,具有一定的實際應用前景和價值。

2.3 鮑魚臟器寡糖的分離純化

采用Sephadex G-25 凝膠柱對鮑魚臟器寡糖混合物進行分子量分級,鮑魚臟器寡糖混合物在凝膠柱上的洗脫曲線如圖5所示。曲線在第13管和第29管出現兩個洗脫峰,第13管的洗脫峰尤為明顯,表明鮑魚臟器寡糖混合物中以這兩個組分為主,且第13管的組分占絕大部分。收集第13管的鮑魚臟器寡糖組分,合并洗脫液,減壓濃縮,冷凍干燥,得鮑魚臟器寡糖產物。

圖5 寡糖混合物的洗脫曲線Fig.5 Elution curve of oligosaccharide mixture

2.4 鮑魚臟器寡糖的紅外光譜分析

圖6 AVO紅外吸收光譜Fig.6 The infrared absorption spectrum of AVO

3 結論

利用固相酸水解鮑魚臟器多糖制備寡糖,通過單因素實驗研究了樹脂用量、水解時間和水解溫度對鮑魚臟器多糖水解率的影響,并用響應面法對鮑魚臟器多糖水解工藝進行優化,得到最佳水解條件為:樹脂用量40 g,水解時間3 h,水解溫度70 ℃。在該條件下進行3次平行試驗,得到鮑魚臟器多糖水解率為80.69%,接近且略高于預測值,表明對鮑魚臟器多糖水解工藝的優化是可行的,為鮑魚臟器的開發利用提供了參考,最后使用葡聚糖凝膠柱層析和紅外光譜分析對降解產物進行了分離純化和結構測定,表明鮑魚臟器寡糖含有吡喃環,為α-型糖。