基于熒光定量PCR鑒定冷鮮肉制品中羊源性成分及其含量

史瑩瑩,邵俊鋒,郭 娟,許慧卿

(揚州大學食品科學與工程學院,江蘇揚州 225127)

羊肉鮮嫩,營養豐富,中醫上具有助元陽、補精血、療肺虛、益勞損的功效,是進補的佳品。我國是羊肉生產和消費大國,群眾對羊肉及肉制品的需求量日益增加[1]。歐洲的“馬肉風波”對肉制品市場影響巨大,國內掛羊頭賣狗肉的假羊肉事件屢見不鮮。用低廉的肉進行摻假,這涉及經濟、營養、食品安全甚至宗教信仰等問題。

目前對肉類種屬鑒別的方法主要有:以特征形態為基礎的感官鑒別、以蛋白質為基礎的免疫學鑒別方法以及以核酸聚合酶鏈式反應為基礎的分子生物學技術等[2-3]。感官鑒別屬于粗略鑒別法,且檢測結果容易受實驗人員的主觀因素影響[4]。由于加工處理過程中蛋白質的質量受肉制品的新鮮度、加工程度等因素的影響,蛋白質性質不穩定,存在干擾結果且重復性差[5-6]。聚合酶鏈式反應(PCR)是利用特異性引物體外擴增目的DNA片段,然后對所得DNA片段進行分析從而達到鑒別物種的目的。常見的PCR技術有常規PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR、數字PCR、DNA測序等[7-8]。自從1998年Tartaglia等[9]首次報道基于普通PCR方法檢測飼料中的牛、羊源性成分,PCR鑒定物種的方法日趨成熟。何瑋玲等[10]利用Cytb基因的差異性位點,設計了相同上游引物但下游各自特異性的4條PCR引物,建立了一種快速定性鑒別豬肉、牛肉、羊肉和雞肉成分的多重PCR方法。微滴數字PCR精確度高但實驗成本昂貴以及實驗條件要求高且操作復雜[11]。實時熒光定量PCR是在PCR反應體系中加入染料或者探針等熒光基團,通過熒光信號強度變化實時監控反應中DNA濃度的變化,從而實現對肉類產品進行鑒定[12]。范麗麗等[13]選擇Taqman實時熒光PCR技術,專門針對牛細胞色素b設計引物和探針,以Ct值在28以內確定牛源性成分的存在。Farrokhi等[14]運用SYBR Green1實時熒光方法對清真認證豬源性成分檢測,通過Tm值顯示擴增特異性,其豬肉最低檢出限達0.1 ng/μn。但目前利用熒光定量PCR檢測方法對肉制品摻假成分進行定性定量的檢測還鮮有報道。因此,在對羊肉種屬定性鑒定的基礎上,擬建立一種對冷鮮羊肉制品中羊肉成分含量的定量檢測方法。考慮到檢測的精準度、操作的難易以及實驗成本的合理性,選擇實時熒光定量方法進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肉及肉制品 揚州市大型農貿市場超市;血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司;TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ Takara公司;TE緩沖液、引物 生工生物工程(上海)股份有限公司。

StepOne Real-time PCR儀 Applied Biosystems,USA;Nanodrop2000核酸蛋白定量儀Thermo Scientific,USA;DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠;Tanon3500凝膠成像一體機 上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 分別取1 g生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肉充分剪碎,置于預冷潔凈的研缽中,用液氮研磨至粉末狀,在粉末未解凍前快速轉入5 mL潔凈離心管,-70 ℃保存。

1.2.2 混合樣品的制備 精確稱取生鮮豬、羊肉(精確度0.0001 g),按質量比混合,得到羊肉質量百分比為10%、30%、50%、70%、90%和5%、15%、45%、65%、95%總質量為1 g的豬羊肉混合肉樣。液氮研缽處理保存方法同1.2.1。

1.2.3 DNA提取 采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取的樣品總DNA。取50 mg上述樣品于1.5 mL潔凈離心管,按提取說明書稍做改進,加入蛋白酶K消化時間延長至6 h直至肌肉組織溶解,后按說明繼續操作。將提取的樣品DNA溶于80 μL TE洗脫液中,于-20 ℃保存備用。

1.2.4 DNA濃度和純度測定 取TE為空白調零,取2 μL樣品,用核酸蛋白測定儀測定提取后的DNA模板的濃度、A260/A280及A260/A230比值。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測模板DNA提取效果。

1.2.5 實時熒光PCR體系

1.2.5.1 引物設計 根據美國NCBI GenBank數據庫公布的羊線粒體細胞色素b基因序列(登錄號MH938654.1),運用Primer Premier 5.0軟件設計篩選對羊有特異性的PCR擴增引物RTY。采用相對定量法,選擇在結構和功能上具高度保守性的16S rDNA作為內參管家基因[15],并且設計一對內源基因引物16S。16S上游引物:5′-ACCGTGCAAAGGTAGCAT AATCA-3′,下游引物:5′-GCTCCATAGGGTCTTC TCGTCTT-3′,產物大小82 bp。RTY上游引物:5′-GGGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-3′,下游引物5′-GATTTTTCGCCTTTCACTTTATT-3′,產物大小243 bp。引物交于上海生工合成,用無菌無酶水溶解,配制成100 μmol/L的儲備液。

1.2.5.2 PCR反應 反應體系10 μL:TBGreen Premix Ex TaqⅡ(TliRNaseH Plus)(2×)5.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ROX Reference Dye(50×)0.2 μL,DNA模板1.0 μL,滅菌水3.0 μL。兩步法PCR擴增程序:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火 30 s,共40個循環。對熔解曲線進行分析,無引物二聚體和非特異性產物。

1.2.6 引物特異性研究 以市售新鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉5種畜禽肉DNA為模板,濃度統一稀釋至50 ng/μL,各取1 μL,用RTY引物進行實時熒光PCR反應,分析RTY引物擴增的物種特異性。

1.2.7 內參引物通用性 研究以市售新鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉5種畜禽肉DNA為模板,濃度統一稀釋至50 ng/μL,各取1 μL,用16S內參引物進行實時熒光PCR反應,分析內參引物對常見物種擴增的通用性。

1.2.8 引物靈敏度檢測 將提取的羊肉DNA原液稀釋至50 ng/μL,然后進行5倍系列梯度稀釋,即50、10、2 ng/μL、400、80、16、3.2、0.64 pg/μL等梯度,去離子水作為陰性對照模版,進行實時熒光PCR檢測。

1.2.10 模擬混合肉樣檢測 以總質量50 mg且已知質量比為5%、15%、45%、65%、95%豬羊混合肉樣,分別提取DNA,濃度統一至50 ng/μL。進行實時熒光PCR反應。以16SrDNA作為內參,將ΔCt值帶入1.2.9所建立的標準曲線中計算羊源性成分質量百分比。和實際質量百分比做商,計算其回收率,以檢驗標準曲線的準確性。

1.2.11 市售羊肉制品檢測 在大型農貿市場或者超市采購羊肉制品包括羊肉串、肥羊卷、熟食羊肉等。將樣品置于滅菌水浸泡漂洗后提取DNA,按1.2.5所述實驗條件、體系進行實時熒光PCR反應。檢測是否含有羊源性成分,并通過ΔCt值計算樣品中羊肉含量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 DNA濃度和純度測定結果

不同肉類DNA濃度和純度測定結果見表1。核酸提取過程中容易混入蛋白質及碳水化合物等雜質。A260/A280>1.8可以說明溶液中無蛋白質污染,A260/A230比值可以幫助判斷核酸溶液中是否混有糖類等雜質,當A260/A230<2.0時,則說明DNA溶液被碳水化合物污染[16]。由表1可知,取的生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肌肉組織DNA A260/A280、A260/A230比值符合上述要求,未被污染。提取的生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肌肉組織DNA經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示,條帶清晰無拖尾且完整。說明提取的DNA可用于實時熒光PCR反應。

表1 DNA濃度和純度測定結果Table 1 DNA concentration and purity test results

圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 2% agarose gel electrophoresis注:泳道1:生鮮豬;泳道2:生鮮牛;泳道3:生鮮羊;泳道4:生鮮雞;泳道5:生鮮鴨。

2.2 實時熒光PCR引物特異性、內參引物通用性檢測結果

用引物RTY對不同肉的DNA模板進行實時熒光PCR擴增反應,結果如圖2所示。羊DNA模板的16個循環之后即進入指數擴增期,而豬、牛、雞、鴨模板則在28個循環之后,無酶水則>30。羊肉模板和其他肉類Ct值差異明顯,以去無酶水作為陰性對照,引物RTY對非目標物種熒光擴增效率差[17]。即設計的引物RTY對羊源性成分特異性較高。

圖2 引物RTY對不同肉類DNA的擴增曲線Fig.2 Amplification curves of DNA samples derivedfrom different meats using RTY primer

用內參引物16S引物對不同肉的DNA模板進行實時熒光PCR擴增反應,結果如圖3所示。16S對常見的5種畜禽肉有較好的擴增效率,Ct值相對穩定,集中在狹窄范圍內。結果表明,內參引物16S具有通用性,可以作為內參校正基因使用[18]。RTY引物和內參基因16S的熔解曲線Tm值分別為82.86 ℃(圖4)和77.97 ℃(圖5),均為特異的單個峰。熔解曲線則結果表明沒有引物二聚體和其它非特異性峰的存在,目標片段具有高度特異性。

圖3 引物16S對不同肉類DNA的擴增曲線Fig.3 Amplification curves of DNA samples derivedfrom different meats using 16S primer

圖4 引物RTY擴增熔解曲線Fig.4 Melting curves of prime RTY

圖5 內參引物16S擴增熔解曲線Fig.5 Melting curves of internal reference primer 16S

2.3 引物RTY靈敏度檢測

為檢測引物RTY的靈敏度,將提取的羊肉DNA原液稀釋至50 ng/μL,5倍系列梯度稀釋,以去離子無酶水作為陰性對照。對濃度50 ng/μL～0.64 pg/μL的模板DNA進行檢測,結果如圖6所示。當模板濃度低至16 pg/μL時,仍清晰地進行指數擴增。濃度再低時擴增曲線差別小,且和陰性對照結果接近。實驗結果表明,本方法檢測限可達16 pg/μL。

圖6 引物RTY對不同DNA濃度梯度的擴增曲線Fig.6 Amplification curve for different DNAconcentration gradients of primer RTY

2.4 標準曲線的建立

不同羊肉含量的標準品進行實時熒光反應,其對應的Ct值結果表2所示。以標準品中羊肉含量百分對數值lg(羊肉質量含量百分比%)為橫坐標,標準品對應的循環閾值差值ΔCt(ΔCt=Ct羊肉-Ct內參)為縱坐標,得到肉質量百分比的對數值與ΔCt的線性關系,繪制羊肉質量百分比的對數值與ΔCt值之間的標準曲線(圖7)。經Excel模擬出標準曲線回歸公式為y=-3.4057x-0.3112,R2=0.9916,PCR的反應效率E(%)=(10-1/k-1)×100(k為標準曲線斜率),標準曲線E=96.62%。《實時熒光定量國際化標準-MIQE指南》規定:R2>0.980以及90%<擴增效率E<105%。結果表明,本標準曲線具有良好的線性關系和擴增效率,符合實時熒光定量國際化標準的要求。

表2 不同羊肉含量百分比Ct以及ΔCt值檢測結果Table 2 Ct and ΔCt value of differentbeef content percentage standards

圖7 羊肉質量百分比的對數值與ΔCt值之間的標準曲線Fig.7 Standard curve between the log value ofmutton mass percentage and the corresponding ΔCt value

模擬含羊肉質量為5%、15%、45%、65%、95%的豬羊混合肉樣品,按1.2.5反應體系進行檢測。將所得實時熒光PCR測得的數據的ΔCt值代入標準曲線中計算羊肉質量含量百分比,并且計算回收率,以檢驗標準曲線及定量測定的可行性,結果如表3所示。結果表明,檢測的羊肉質量含量百分比與模擬的混合豬羊肉中羊肉質量含量百分比實際值符合程度高。回收率為93.07%～106.20%,較為理想。本試驗建立的量化肉制品中羊肉成分的實時熒光相對定量方法具有實踐意義。

表3 模擬混合肉樣Ct值檢測結果Table 3 Ct value of simulated mixed meat sample

2.6 市售羊肉制品檢測結果

選擇市售8份羊肉制品提取DNA,樣品均來自某市大型農貿市場及超市。樣品包括羊肉串、羊肉卷、熟食羊肉等。利用建立的實時熒光PCR反應體系檢測其羊源性成分,每個樣品設置三個平行,市售羊肉制品的羊肉質量百分比檢測結果如表4所示。其中有3份含量達98%以上,3份含量低于50%,2份含量在60%左右。從市售抽樣結果看,確實存在摻假羊肉制品欺騙消費者的不法現象,相關部門需加強監管以及打擊力度。

表4 市售羊肉制品檢測結果Table 4 Results for quantitative test the commercial meat mixtures

選擇實時熒光PCR方法,以羊線粒體細胞色素b為靶位基因,設計出對羊有特異性擴增的引物。在檢測結果能是否檢出的羊源性成分定性判斷基礎上,選擇16S rDNA為內參引物,外源性基因以及內參基因聯用進行檢測。羊肉質量百分比的對數值與之對應的循環閾值差值ΔCt呈良好線性關系。標準曲線回歸公式為y=-3.4057x-0.3112,R2=0.9916,擴增效率達E達96.62%。本試驗中羊源性DNA檢測限可達16 pg/μL。通過對標準曲線進行質量評估,證明該方法適用于對羊肉成分的鑒定以及含量的檢測。本方法不需要設計復雜又昂貴的熒光探針,封閉體系無需后續的電泳以及紫外拍照等操作,很大程度縮短了檢測時間,并且減少PCR產物污染避免假陽性,實驗結果較為準確。現行有效的對牛羊源性成分的定性檢測國標方法僅適用于飼料中(GB/T 20190-2006)[19],還沒制定出牛羊肉制品相關的國標檢測方法,本方法可為其研究提供參考意見。本文僅提出了針對生鮮冷凍肉制品的羊源性成分的鑒定以及含量測定的方法,對不同加工方法之后的肉制品鑒定方法還需進一步探究。