沙棘酵素發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物及抗氧化活性研究

張浩然,范昊安,顧逸菲,王珍珍,沙如意,*,毛建衛(wèi),4,*

(1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310023;3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310023;4.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江紹興 312006)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)是一種落葉性灌木[1],具有耐旱、抗風(fēng)沙、可以在鹽堿化土地上生存的特性,因此被廣泛用于水土保持,特別是在中國西北部地區(qū),由于沙漠綠化的需要,種植有大量沙棘[2-3]。沙棘為藥食同源植物,其果實(shí)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì),包括人體所需要的各種氨基酸、脂肪酸、維生素、亞油酸、超氧化物歧化酶等活性物質(zhì),以及異鼠李素、槲皮素等7種黃酮類物質(zhì)和多種微量元素,具有增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、保護(hù)肝臟、保護(hù)胃腸道、加快細(xì)胞的造血、抗輻射、抗突變、抗腫瘤等作用[4-8]。

沙棘在食品、醫(yī)藥、輕工、農(nóng)牧漁業(yè)等國民經(jīng)濟(jì)的許多領(lǐng)域都有很好的應(yīng)用前景[2,9]。市面上比較流行的沙棘產(chǎn)品有沙棘果汁、沙棘茶、沙棘鈣片、沙棘膠囊、沙棘果油、沙棘籽油等[3]。沙棘的一個(gè)新的研究方向是通過發(fā)酵來制備沙棘酵素,目前,關(guān)于沙棘酵素的研究較少。食用植物酵素(Edible plant source Jiaosu)是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、藥食兩用本草類等為原料,加(或不加)糖類物質(zhì),經(jīng)多種有益菌通過較長時(shí)間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品,擁有豐富的次生代謝產(chǎn)物、植物本身營養(yǎng)成分和益生菌等功能成分,特別是富有小分子功能成分,研究表明該類產(chǎn)品具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能[10-13]。開發(fā)沙棘酵素,加強(qiáng)對于沙棘酵素的研究有利于促進(jìn)沙棘產(chǎn)業(yè)向深層次發(fā)展。

本文以野生沙棘果實(shí)為原料,研究沙棘酵素在發(fā)酵過程中總糖、總酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、醋酸、總酚等活性成分含量、抗氧化活性(羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原力)變化以及微生物菌落總數(shù)變化規(guī)律,同時(shí)利用相關(guān)性分析和主成分分析對各評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析,為沙棘的綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生沙棘果實(shí) 采自山西呂梁山,2018年2月采樣;低聚異麥芽糖 由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;雙氧水(H2O2)、福林酚(10%)、鐵氰化鉀、三氯化鐵、蒽酮、甲醇、碳酸鈣、氯化鈉(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇、抗壞血酸(VC)、三氯乙酸、2,2-聯(lián)氮基-雙-二胺鹽(ABTS)(分析純)、磷酸二氫鉀(HPLC級) 上海阿拉丁試劑有限公司;甲醇 HPLC級,美國天地有限公司;葡萄糖、胰蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂 杭州百思生物科技有限公司;草酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品 國家食品藥品檢測中心;酒石酸 Sigma公司;抗壞血酸、莽草酸、沒食子酸、醋酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

PTX-FA210型電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司;Allegra X-12R離心機(jī) 貝克曼庫爾特有限公司;PHS-3C型精密酸度計(jì) 杭州齊威儀器有限公司;KQ-300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV-5500PC型紫外分光光度計(jì) 上海市元析儀器有限公司;XMTD-204型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 常州諾基儀器有限公司;Waters e2695型高效液相色譜(配備Waters 2998二極管陣列紫外檢測器) Waters公司;MB-150CL型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 青島明博環(huán)保科技有限公司;20L不銹鋼發(fā)酵罐 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 PCA培養(yǎng)基:酵母粉2.5 g,蛋白胨5 g,葡萄糖1 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃濕熱滅菌15 min。

YEPD培養(yǎng)基:酵母粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃濕熱滅菌15 min。

GYCA培養(yǎng)基:酵母粉5 g,蛋白胨3 g,葡萄糖30 g,碳酸鈣10 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃濕熱滅菌15 min。

1.2.2 沙棘酵素的制備 取滅菌、冷卻后的無菌水輕輕沖洗沙棘表面,自然瀝干、打漿,按沙棘∶低聚異麥芽糖∶水的質(zhì)量比3∶3∶1,加入滅菌過的發(fā)酵罐,密閉、室溫發(fā)酵,每隔10 d取一定量發(fā)酵液,8000 r/min條件下離心10 min,保留上層清液備用。

1.2.3 總酚含量測定 采用福林酚法[14]測定樣品中總酚含量。取30 μL沙棘酵素離心上清液,加水至0.5 mL,加入10%福林酚溶液(v/v)2.5 mL,常溫靜置反應(yīng)3 min,加入7.5% Na2CO3溶液(w/v)2 mL,混勻,于25 ℃反應(yīng)1 h,以去離子水為空白,在765 nm下測定吸光度。并以沒食子酸為標(biāo)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 pH測定 參照GB 10468-1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH的測定方法》[15],使用精密pH計(jì)測定樣品pH。

1.2.5 總酸含量測定 參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定方法》[16],取樣品0.5 mL,加水定容至50 mL,取10 mL稀釋液于錐形瓶中,以1%酚酞試劑為指示劑,記錄消耗0.01 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定體積,計(jì)算總酸含量(以蘋果酸計(jì))。

1.2.6 有機(jī)酸種類及含量測定 樣品配制:用流動相將樣品稀釋5倍,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,采用HPLC檢測有機(jī)酸含量。

混合標(biāo)準(zhǔn)品配制:配制草酸、L-酒石酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、沒食子酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,其質(zhì)量濃度分別為0.1、0.1、0.5、0.01、0.1、1、1、0.01、1、0.01、1、0.01 mg/mL。

色譜條件:色譜柱為Atiantis? T3 C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇:磷酸二氫鉀緩沖液(pH2.7)=2∶98 (v/v);流速為1.0 mL/min;柱溫為20 ℃;檢測波長為210 nm；檢測器:二極管陣列檢測器。

1.2.7 總糖含量測定 采用蒽酮-硫酸法[17]測定樣品中總糖含量。分別配制20、40、60、80、120、160 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,各標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,加入4 mL 2 mg/mL蒽酮-硫酸溶液,混合均勻后置于沸水浴中反應(yīng)10 min,冰浴中冷卻至室溫后,在620 nm處測定其吸光度,繪制得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。沙棘酵素發(fā)酵液樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后,采用上述方法測定總糖含量。

1.2.8 羥基自由基清除能力的測定 取50 μL樣品,加去離子水補(bǔ)至2 mL,加入1.4 mL 6 mmol/L H2O2溶液,0.6 mL 20 mmol/L水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L硫酸亞鐵,混勻,37 ℃下恒溫水浴1 h。在510 nm下,以去離子水為空白,檢測樣品吸光度。羥基自由基清除能力計(jì)算見式(1)[18-19]。

式(1)

式中,A0是空白對照液的吸光度,A1為樣品測定管的吸光度,A2為樣品本底管的吸光度。

1.2.9 ABTS自由基清除能力的測定 用5 mmol/L pH7.4的PBS緩沖液將ABTS稀釋到7 mmol/L,加入過硫酸鉀溶液,得到最終濃度為2.45 mmol/L ABTS溶液,在暗處室溫放置12～16 h。使用前,在波長734 nm處,用PBS緩沖液將ABTS溶液稀釋,使其吸光度為0.70±0.02。

取7.5 μL樣品,用上述PBS溶液補(bǔ)足至300 μL,加入5 mL上述ABTS自由基稀釋液,30 ℃下反應(yīng)1 h,734 nm下測吸光度。ABTS自由基清除能力計(jì)算見式(2)[20]。

式(2)

式中,A0是空白對照液的吸光度,A1為樣品測定管的吸光度,A2為樣品本底管的吸光度。

1.2.10 還原力的測定 取50 μL樣品,加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)補(bǔ)足至2.5 mL,加入1%(w/v)鐵氰化鉀水溶液2.5 mL,混合均勻,于50 ℃恒溫反應(yīng)30 min,加入10%(w/v)三氯乙酸水溶液2.5 mL,混勻,避光靜置10 min,取2.5 mL上清液,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%(w/v)三氯化鐵水溶液,混勻,在700 nm下,以去離子水為空白,檢測樣品吸光度[21]。

1.2.11 菌落總數(shù)的測定 參照GB 4789.2-2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[22]的方法,用10倍稀釋法,將體積分?jǐn)?shù)分別為10-2～10-5稀釋菌液涂布于PCA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.2.12 酵母菌菌落數(shù)的測定 參照GB 4789.15-2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[23]的方法,用10倍稀釋法,將體積分?jǐn)?shù)分別為10-2～10-5稀釋菌液涂布于YEPD培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.2.13 醋酸菌菌落數(shù)的測定 參照王玉冰[2]的方法,用10倍稀釋法,將體積分?jǐn)?shù)分別為10-2～10-5稀釋菌液涂布于GYCA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,采用Origin 8.6進(jìn)行繪圖,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,y=0.0104x-0.0253,R2=0.9998。沙棘酵素發(fā)酵過程中總酚含量變化如圖2所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,總酚含量呈先快速上升然后再趨于動態(tài)平衡的趨勢。發(fā)酵到第40 d,總酚含量達(dá)到最高,為1.29 mg/mL。發(fā)酵前40 d,總酚含量快速上升,可能主要與此階段沙棘中多酚類物質(zhì)在高滲透壓作用下逐漸溶出以及微生物代謝有關(guān)。

圖2 發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.2 Changes of total phenolic content during fermentation

2.2 沙棘酵素發(fā)酵過程中總酸含量與pH的變化

總酸在一定程度上可反映酵素發(fā)酵中微生物生長代謝情況,而pH通常可以作為判定微生物生長正常與否的重要指標(biāo)。沙棘酵素發(fā)酵過程中總酸與pH含量變化趨勢如圖3所示,發(fā)酵過程中pH呈先降低再動態(tài)平衡的趨勢,總酸含量整體上呈先快速增加再動態(tài)平衡的趨勢。

圖3 發(fā)酵過程中總酸和pH的變化Fig.3 Changes in total acid and pH during fermentation

在發(fā)酵的前20 d,pH迅速下降,總酸含量明顯提高,這可能是由于原料中有機(jī)酸的大量溶出及醋酸菌等大量微生物代謝產(chǎn)生了醋酸等有機(jī)酸[24-26]。20 d后,pH基本穩(wěn)定,總酸含量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢,發(fā)酵到第100 d,總酸含量達(dá)到最高為80.80 mg/mL。沙棘酵素在發(fā)酵過程中的總酸含量和pH變化趨勢與火龍果酵素、蘋果酵素基本一致,只是趨于穩(wěn)定的時(shí)間有所區(qū)別(火龍果酵素是40 d,蘋果酵素是14 d),這可能與原料的品種特性以及參與自然發(fā)酵的微生物種類不同有關(guān)[2,27]。

2.3 沙棘酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化

各有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。沙棘酵素不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的樣品中的有機(jī)酸種類及含量變化見表2。由表2可知,沙棘酵素發(fā)酵過程中檢測到草酸、酒石酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、醋酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸和沒食子酸,其中蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸的含量較高,呈先明顯升高再緩慢降低的趨勢。吳紫潔等[28]研究了12個(gè)沙棘品種果實(shí)中的有機(jī)酸組分,發(fā)現(xiàn)沙棘果實(shí)的有機(jī)酸有草酸、奎尼酸、蘋果酸、抗壞血酸和檸檬酸;戴達(dá)勇等[29]研究表明沙棘果粉中蘋果酸含量最高。由表2可知,醋酸和琥珀酸含量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢,其余幾種有機(jī)酸的含量較低且變化不明顯;發(fā)酵過程中未檢測到乳酸;沙棘酵素中醋酸的含量明顯增加,經(jīng)過100 d的發(fā)酵,從0.19203 mg/mL增加到1.31003 mg/mL,這可能是由于在發(fā)酵過程中,醋酸菌代謝旺盛,利用糖生成醋酸。發(fā)酵過程中新檢測到的有機(jī)酸有馬來酸、琥珀酸和沒食子酸,其中琥珀酸含量增加較為顯著,從第20 d開始檢測到琥珀酸,發(fā)酵100 d時(shí),其含量為0.73932 mg/mL。Tsuji等[30]研究表明酵母菌等微生物發(fā)酵形成琥珀酸的路徑有三條:TCA循環(huán)的還原性分支,其主要在完全厭氧條件下活化;TCA循環(huán)的氧化分支,其主要在有氧條件下活化;以及乙醛酸支路。本實(shí)驗(yàn)中琥珀酸含量的增加可能是酵母菌在代謝過程中大量繁殖造成的。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curves of organic acids

表2 發(fā)酵過程中12種有機(jī)酸變化Table 2 Changes of twelve organic acids during fermentation

沙棘果實(shí)經(jīng)過微生物發(fā)酵后,含量最高的仍為蘋果酸,同時(shí)形成了新的有機(jī)酸,包括馬來酸、琥珀酸和沒食子酸,醋酸含量也明顯增加,這對其發(fā)揮生物學(xué)活性具有重要作用和意義。

2.4 沙棘酵素發(fā)酵過程中總糖含量的變化

總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示,y=0.00274x-0.00368,R2=0.9992。糖作為酵素發(fā)酵過程中微生物利用的主要碳源,其含量變化可以作為微生物代謝的核心指標(biāo)之一。沙棘酵素發(fā)酵過程中的總糖含量變化如圖5所示。發(fā)酵的前30 d,總糖含量快速下降,在這個(gè)時(shí)間段內(nèi),一方面沙棘果原料中的水分在高糖滲透壓條件下,逐漸滲出,稀釋發(fā)酵液中的糖,使得發(fā)酵液中糖含量降低;另一方面,糖被酵母菌、醋酸菌等微生物作為碳源利用,用于合成和分解代謝[31]。楊小幸等[27]研究表明蘋果酵素中的蔗糖在21 d內(nèi)被分解為葡萄糖和果糖,二者又被酵母菌和醋酸等微生物利用生成乙醇和醋酸等代謝產(chǎn)物。發(fā)酵至第50 d,總糖含量降低至初始總糖含量的49.94%,為0.42 g/mL;之后,總糖含量有緩慢增加的趨勢并逐漸趨于穩(wěn)定,發(fā)酵至第100 d,總糖濃度相比最低點(diǎn)上升5.78%,這可能是由于微生物的生長繁殖和代謝導(dǎo)致發(fā)酵液中的總糖濃度下降與含糖代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生共同影響造成的。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of glucose

圖5 發(fā)酵過程中總糖含量變化Fig.5 Changes in concentration oftotal sugar during fermentation

2.5 沙棘酵素發(fā)酵過程中抗氧化性能評價(jià)

2.5.1 羥基自由基清除能力的變化 羥基自由基是人體內(nèi)一種常見的自由基,同時(shí)也是一種毒性最強(qiáng)的活性氧自由基,能夠殺死紅細(xì)胞,引起細(xì)胞膜、DNA等結(jié)構(gòu)的氧化損傷[32]。沙棘酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力變化情況如圖6所示,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,沙棘酵素對羥基自由基清除能力明顯提高,發(fā)酵至40 d清除率達(dá)到最高為64.44%,隨后清除率趨于穩(wěn)定。Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)沙棘原料的抗氧化能力較低,而本文中沙棘經(jīng)過發(fā)酵后,沙棘酵素的抗氧化能力提高非常明顯。沙棘酵素具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力,可能與其含有的酚類物質(zhì)含量較高有關(guān),Seyda等[34]研究表明酚類物質(zhì)可以提供大量氫離子,經(jīng)過共振雜化會變得穩(wěn)定,從而促進(jìn)了自由基清除能力的提高。

圖6 發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力變化Fig.6 Changes in hydroxyl free radicalscavenging ability during the fermentation

2.5.2 ABTS自由基清除能力的變化 ABTS自由基常被用作親水性和親脂性物質(zhì)的抗氧化能力的評價(jià)。沙棘酵素發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力變化情況如圖7所示,發(fā)酵的前40 d,ABTS自由基的清除能力明顯增強(qiáng),發(fā)酵至第40 d時(shí)清除率達(dá)到47.45%,40 d之后清除率有明顯上下浮動。Floegel等[35]研究表明與DPPH自由基清除能力相比較,ABTS自由基的抗氧化活性效果更好,特別是對于色素含量較高和親水性原料。Erel等[36]研究表明酚類物質(zhì)與ABTS自由基的清除能力具有顯著的正相關(guān)性,其中酚類物質(zhì)的分子質(zhì)量、羥基取代基的性質(zhì)和芳香環(huán)的數(shù)量起到了關(guān)鍵作用。

圖7 發(fā)酵過程中對ABTS自由基清除能力變化Fig.7 Changes in ABTS free radicalscavenging ability during the fermentation

2.5.3 還原力的變化 還原力是反映抗氧化能力的另一指標(biāo),與多種抗氧化機(jī)制有關(guān),包括還原能、結(jié)合自由基的清除、過氧化物的降解等,樣品的還原能力與吸光度呈正相關(guān)[37-38],通過測定反應(yīng)液在700 nm處的吸光度來評價(jià)還原力的大小。沙棘酵素發(fā)酵過程中還原力的變化情況如圖8所示,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,還原力明顯提高,至40 d達(dá)到0.55,隨后還原力又緩慢上升并趨于穩(wěn)定的趨勢,整體呈現(xiàn)“先快后慢”的趨勢。

圖8 發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.8 Changes in reducing power during fermentation

2.6 沙棘酵素抗氧化活性與代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析

沙棘酵素在不同發(fā)酵時(shí)間的樣品具有明顯的羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和較高的還原力,這可能與沙棘酵素中含有的總酚、總酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、醋酸、琥珀酸、總糖等代謝產(chǎn)物有關(guān)。沙棘酵素的抗氧化活性影響指標(biāo)眾多,眾多指標(biāo)之間可能會存在著部分信息的冗余,因而可以利用相關(guān)性分析來排除眾多相關(guān)變量的影響,對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果如表3所示。

表3 經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后各參數(shù)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of parameters after normalization

表5 旋轉(zhuǎn)前因子載荷矩陣Table 5 Rotated component matrix

由表3可知,在沙棘酵素發(fā)酵過程中,羥基自由基、ABTS自由基的清除能力和還原力這3個(gè)抗氧化指標(biāo)之間呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)性(P<0.01),總酚、總酸和琥珀酸與3個(gè)抗氧化能力指標(biāo)之間具有極顯著的正相關(guān)性(P<0.01),醋酸與3個(gè)抗氧化能力指標(biāo)之間具有良好的正相關(guān)性(P<0.05),可見沙棘酵素所含的酚類物質(zhì)和有機(jī)酸等物質(zhì)具有一定的抗氧化作用。總糖含量與抗氧化活性具有極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),說明發(fā)酵過程中微生物利用糖類物質(zhì)代謝產(chǎn)生酚類等活性物質(zhì),從而提高了沙棘酵素的抗氧化活性。潘梓源等[39]研究表明桂圓酵素經(jīng)過微生物發(fā)酵總酚含量是原桂圓水提液的5.05倍,其中新生成的酚類物質(zhì)至少有16種,是多種微生物代謝產(chǎn)生的結(jié)果。

2.7 主成分分析

2.7.1 主成分分析的特征值 為了進(jìn)一步明確沙棘酵素中各變量之間的相互關(guān)系,通過主成分分析對各變量進(jìn)行降維處理。

沙棘酵素主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率如表4所示。以特征值1.0為納入標(biāo)準(zhǔn),提取出2個(gè)主成分。其中第1主成分的貢獻(xiàn)率為69.166%,第2主成分的貢獻(xiàn)率為22.305%,二者累積方差貢獻(xiàn)率高達(dá)91.471%,即二者能夠反映原始變量91.471%的信息,可以用于描述大部分變量的信息。其中,第一主成分反映了總糖、羥基自由基清除率、還原力、總酚、ABTS自由基清除率、琥珀酸、總酸、pH和醋酸的變異信息,第二主成分反映了蘋果酸、抗壞血酸和酒石酸的變異信息。因此,對原先的12種變量指標(biāo)進(jìn)行降維處理后獲得2個(gè)新的變量,2個(gè)新變量分別用F1、F2表示,它們之間的線性關(guān)系為:

表4 主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率Table 4 The eigenvalue,contribution rate and thecumulative contribution rate of principal components

F1=-0.343×ZTS+0.341×ZHR+0.338×ZRP+0.338×ZTPC+0.337×ZABTS+0.333×ZSUA+0.329×ZAC-0.314×ZpH+0.251×ZACA-0.014×ZMAA-0.103×ZVC+0.179×ZTAA

F2=0.019×ZTS+0.007×ZHR-0.094×ZRP-0.043×ZTPC+0.064×ZABTS-0.150×ZSUA+0.091×ZAC-0.166×ZpH-0.097×ZACA+0.607×ZMAA+0.560×ZVC+0.485×ZTAA

2.7.2 主成分分析法構(gòu)建抗氧化能力綜合評價(jià)指標(biāo) 通過主成分分析法構(gòu)建不同發(fā)酵時(shí)間樣品的綜合評價(jià)指標(biāo)(Comprehensive evaluation index,CEI),即以每個(gè)主成分所對應(yīng)的特征值占所提取主成分的特征值之和的比例,再進(jìn)行線性加權(quán)求和得到綜合評價(jià)指標(biāo)。

式(3)

不同發(fā)酵時(shí)間沙棘酵素的綜合評價(jià)指標(biāo)如圖9所示。發(fā)酵前40 d的CEI值明顯升高,發(fā)酵40 d之后上升趨勢明顯減緩并趨于平穩(wěn)。參考CEI值的變化,結(jié)果表明,發(fā)酵至40 d,各種代謝指標(biāo)已基本穩(wěn)定。

圖9 沙棘酵素綜合評價(jià)指標(biāo)圖Fig.9 Comprehensive evaluation index of seabuckthorn jiaosu

2.8 沙棘酵素發(fā)酵過程中微生物菌群的變化

對沙棘酵素發(fā)酵過程中菌落總數(shù)、酵母菌、醋酸菌等菌落數(shù)量變化進(jìn)行研究,如圖10所示。從酵母菌和醋酸菌菌落數(shù)的變化趨勢可以明顯看到遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期[40]。在發(fā)酵初期,由于菌種對生長環(huán)境需要適應(yīng),使得10～20 d的酵母菌和醋酸菌菌種數(shù)量增加緩慢,即二者需要經(jīng)歷遲緩期來適應(yīng)環(huán)境,所以菌落數(shù)增加較少;隨后20～30 d的酵母菌和20～40 d的醋酸菌分別進(jìn)入對數(shù)生長期,二者適應(yīng)環(huán)境之后數(shù)量快速增加;隨后菌種的繁殖達(dá)到動態(tài)平衡,酵母菌和醋酸菌分別在30～60 d和40～80 d進(jìn)入穩(wěn)定期;最后當(dāng)外部的環(huán)境不再適合菌種生長時(shí),即菌種的分解代謝超過了合成代謝,導(dǎo)致酵母菌在最后的60～100 d開始進(jìn)入衰退期。

圖10 發(fā)酵過程中微生物菌群的變化Fig.10 Changes in the microbialcommunity during fermentation注:A:菌落總數(shù);B:酵母菌;C:醋酸菌。

菌落數(shù)與總酚和總酸的變化趨勢基本一致,醋酸菌數(shù)量的增加驗(yàn)證了發(fā)酵過程中醋酸含量不斷增加的原因,酵母菌含量的增加可能是導(dǎo)致發(fā)酵過程中琥珀酸含量增加的原因。葉陵等[41]研究表明剁辣椒在短期自然發(fā)酵過程中菌落總數(shù)和酵母菌菌落數(shù)呈現(xiàn)先增加再趨于平衡的趨勢,發(fā)酵初期的養(yǎng)分充足,微生物快速生長,但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,微生物代謝產(chǎn)生的醋酸等物質(zhì)具有抗菌活性,從而使菌株生長放緩,這與本研究結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

總酚與總酸含量、抗氧化能力(羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、還原力)呈先快速上升再動態(tài)平衡的趨勢;pH、總糖含量呈先快速降低再動態(tài)平衡的趨勢;沙棘酵素中的有機(jī)酸主要以酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸為主,發(fā)酵過程中新檢測到的有機(jī)酸有馬來酸、琥珀酸和沒食子酸,醋酸和琥珀酸呈現(xiàn)不斷增加的趨勢。綜合評價(jià)指標(biāo)分析結(jié)果表明:發(fā)酵前40 d的CEI呈逐漸上升趨勢,40 d之后上升趨勢明顯減緩并趨于平穩(wěn),說明發(fā)酵至40 d,各種代謝指標(biāo)已基本穩(wěn)定。對沙棘酵素發(fā)酵過程中的菌落總數(shù)、酵母菌和醋酸菌數(shù)量進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)沙棘酵素發(fā)酵過程中醋酸菌呈先快速上升再動態(tài)平衡的趨勢,酵母菌呈先快速上升再動態(tài)平衡最后緩慢下降的趨勢,從微生物的角度反映了沙棘酵素的代謝過程。