溫度敏感型淀粉基聚合物載體的制備、表征及性能分析

寇宗亮,關 欣,藍麗紅,張金彥,李湘靜,黃思穎,藍 平

(廣西民族大學化學化工學院,廣西多糖材料及改性重點實驗室,廣西高校化學與生物轉化過程新技術重點實驗室,廣西南寧 530006)

淀粉是一種天然多糖,具有無毒性、相容性良好、非免疫原性和低抗原性等特點[1-3],作為一種無毒和生物可降解的聚合物材料已被廣泛地用于制備生物納米載體[4]。其有大量可被修飾的官能團,當釋放功能性物質后可降解為寡糖且易吸收,不會導致炎癥發生[5]。由于天然淀粉存在水溶性差、糊化液易老化[6]等缺點,使其應用受到限制。

為了拓寬木薯淀粉的應用范圍,研究者們通過物理[7-8]、化學、生物[9]等改性方法對淀粉進行功能化修飾,使其廣泛應用于食品、醫藥[10-11]、化工等各個領域。由于化學改性可以通過在淀粉分子的羥基上引入功能性基團使其獲得其他功能特性,近年來受到人們的追捧[12]。通過淀粉分子上的羥基與其他基團進行反應,可以制備各種功能性物質載體[13-14]。然而在食品包裝部和各種抗性食品的應用中,多為玉米淀粉[15],木薯淀粉的應用較為鮮見。

膠束作為功能性載體的一種,近年來因體內循環穩定性好,常被用作傳遞介質,受到的關注程度越來越高[16]。兩親性聚合物的親水片段和疏水片段在濃度較低時,聚合物分子以單分子的形式存在;當聚合物濃度達到某一數值后,聚合物分子能夠自組裝形成聚合物膠束[17-18]。

為了改善木薯淀粉諸多缺點限制,拓寬其在食品醫藥領域的應用,本研究利用木薯淀粉作為基材,首先以異丙基縮水甘油醚作為溫度敏感的疏水基團,接枝于淀粉分子骨架上將淀粉分子功能化。然后接枝生物相容性的聚乙二醇(mPEG)作為親水基團。利用傅里葉紅外變換光譜(FTIR)、核磁共振(1H-NMR)對其化學結構進行表征,驗證木薯淀粉基聚合物是否成功合成。然后利用透射電鏡(TEM)、熒光分子探針和馬爾文激光納米粒度散射儀對其形貌和粒徑進行表征。最后以姜黃素作為藥物模型,進一步探究其在不同溫度環境中的釋放行為。為制備新型溫度敏感型淀粉基膠束提供了理論依據,進一步拓寬了木薯淀粉的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木薯淀粉 工業級,廣西武鳴安寧淀粉有限公司;聚乙二醇(PEG,Mn=4000) 分析純,廣東光華化學廠有限公司;羧基封端聚乙二醇 根據參考文獻步驟合成[20];丁二酸酐(SA) 分析純,阿拉丁;姜黃素、N-(3-二甲基氨丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP) 分析純,麥克林。

DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;MAGNA-1R550傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR) 美國Thermo 公司;Cary100紫外-可見分光光度計 Agilent Technologies;冷凍干燥機 埃朗科技國際貿易(上海)有限公司;600 MHZ核磁共振波譜儀(1H-NMR)、透射電子顯微鏡(TEM) Hitachi日立;F-7000熒光分光光度計 日本株式會社日立高新技術。

1.2 實驗方法

1.2.1 疏水淀粉(St-R)的制備 首先對木薯淀粉進行降解處理[19],將原淀粉25 g,無水甲醇100 mL加入三口瓶中,然后滴加濃鹽酸4 mL,0.5 h后,加熱至50 ℃反應5 h,冷卻至室溫后,先用碳酸鈉進行中和,然后抽濾,用甲醇洗滌,干燥備用。

疏水化處理參照楊錦東[19]的方法,在裝有10 mL去離子水的三口瓶中加入5 g降解淀粉,攪拌條件下加入0.5 g的氫氧化鈉,隨后升溫至70 ℃,堿化反應1 h。然后緩慢滴加12 g疏水醚化劑,繼續反應5 h。待反應結束后,冷卻到室溫,并用冰醋酸中和至中性,過濾。產物用50%丙酮反復洗滌數次,將析出的產品干燥后稱重保存以備后用。

1.2.2 疏水淀粉(St-R)接枝聚乙二醇共聚物的制備(R-St-mPEG)

1.2.2.1 羧基封端聚乙二醇的制備 參照文獻[20]中的方法,稱取3.8 g聚乙二醇(mPEG)、0.6 g丁二酸酐(SA)和0.01 g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在100 mL 的二氯甲烷中,在25 ℃下攪拌48 h。旋蒸除去大量的二氯甲烷之后,反應物用四氫呋喃溶解,然后用乙醚在分液漏斗中多次洗滌、沉降。最后真空干燥,得到羧基封端的聚合物mPEG-COOH。

1.2.2.2 疏水淀粉接枝聚乙二醇接枝的制備 參照文獻方法[21],將1 g疏水淀粉(St-R)和9.4 g羧基封端的聚乙二醇溶解在裝有60 mL二甲亞砜(DMSO)溶劑的反應瓶中,在攪拌的條件下加入N-(3-二甲基氨丙基)-N′-乙基碳二亞胺(EDC)0.72 g和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)0.023 g,反應在常溫下反應。隨后,溶劑和未反應的反應物通過透析除去。然后將溶液過濾,冷凍干燥即得烷基淀粉接枝聚乙二醇共聚物R-St-mPEG。

1.2.3 膠束溶液的制備 取1.2.2.2制備的聚合物100 mg于裝有100 mL PBS緩沖溶液的100 mL容量瓶中,室溫振搖48 h,100 W超聲10 min,使得聚合物在水溶液中充分分散。0.45 μm濾膜過濾,得澄清的膠束溶液。

1.2.4 測試及表征

1.2.4.1 傅里葉紅外變換光譜分析 取1～2 mg干燥的聚合物樣品,與50～100 mg干燥的KBr粉末混合,置于瑪瑙研缽中充分研磨,將研磨好的混合物粉末放入壓模中,在10 kPa的壓力下壓制成透明薄片,然后小心地將壓片取出,放入紅外光譜儀進行測試,4000～5000 cm-1波長范圍內掃描。

1.2.4.2 核磁共振分析 稱取30～50 mg的聚合物,用DMSO-d6為溶劑在樣品管中溶解,為了使得樣品充分溶解,用超聲清洗器在100 W的功率條件下超聲10 min。最后將溶解好的樣品裝入核磁管,在室溫下檢測聚合物的氫譜。

1.2.4.3 臨界膠束濃度(CMC)測定 臨界膠束濃度的測定采用芘的熒光探針法分析。熒光探針芘標準貯備溶液的配制(6×10-6mol/L):用分析天平準確地稱取芘0.0012 g,燒杯中用適量丙酮溶解后轉入1 L容量瓶中,用丙酮定容并搖勻,配制得到濃度為6×10-6mol/L的芘丙酮貯備溶液,使用時在膠束水溶液中保持6×10-7mol/L的最終濃度。

膠束系列標準工作溶液的配制:分別取1 mL配制的芘丙酮溶液于幾個燒瓶中,讓其完全揮發備用。再稱取100 mg凍干材料粉末兩份分別于100 mL容量瓶中,加不同pH緩沖溶液溶解定容,取不同量上述膠束溶液進行稀釋,配制成1～1×10-4mol/L不同濃度系列的膠束溶液。將不同濃度的膠束水溶液分別取10 mL,分別加入上述含芘的燒瓶中。

1.2.4.4 透射電鏡觀察 取1.2.3制備的膠束溶液滴于鋪有三百目銅篩的碳膜上,用濾紙除去多余水分,在自然條件下干燥,然后用加速電壓為80 kV掃描。

1.2.4.5 粒徑表征 采用激光納米粒度分析儀測定,用PBS緩沖溶液制備濃度為1.0 mg/mL的膠束溶液,取適量樣品加入比色皿中,參數設置為檢測器位置:173 °,溫度:25 ℃,淀粉折射率:1.53,緩沖溶液折射率:1.33。

1.2.5 負載性能的探究

1.2.5.1 負載膠束的制備 精確稱取25 mg姜黃素,將其置于燒杯中,用DMSO溶解后,將姜黃素的DMSO溶液移到250 mL容量瓶中,再用DMSO進行定容,得到100 μg/mL的儲備液。精密移取2、3、4、5、6 mL 100 μg/mL的儲備液,將其分別移到100 mL的容量瓶中,用DMSO進行定容,即制成2～6 μg/mL系列標準溶液。用DMSO做空白對照液,分別在427 nm處測定其吸光度。W濃度(C,μg/mL)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,繪制姜黃素在DMSO中的標準曲線。稱取8～16 mg姜黃素溶于4 mL DMSO,另稱取100 mg 聚合物,溶于6 mL DMSO中,磁力攪拌使其完全溶解;在劇烈攪拌下,將4 mL姜黃素DMSO溶液緩慢滴入聚合物溶液中,室溫避光攪拌5 min,混合均勻,將混勻后液體轉移至透析袋內(透析膜截留分子量為3500 Da),對蒸餾水透析24 h,開始每隔12 h換水1次除去有機溶劑,5000 r/min離心除去藥物沉淀,得上清液,即為載姜黃素納米膠束。選取不同總投藥量(8、10、12、14、16 mg),固定材料每次用量為100 mg,以考察最大負載量。

式(1)

1.2.5.2 溫度響應條件的研究 精確稱取25 mg姜黃素,用PBS緩沖液溶解,轉移到250 mL容量瓶中,用PBS緩沖液定容,即得到100 μg/mL的藥物溶液,精密移取2、3、4、5、6 mL的藥物溶液到100 mL容量瓶定容,即制得濃度為2～6 μg/mL系列標準溶液。用PBS做空白對照液,427 nm處測定吸收波長。繪制得到姜黃素在PBS中的標準曲線。稱取一定量的負載膠束,將其溶解在不同溫度的PBS緩沖溶液中(含0.5%吐溫80),使其濃度為1 mg/mL。量取5 mL的上述膠束溶液,裝入預先處理好的透析袋,再放置于30 mL的PBS緩沖溶液中,分別于25、37 ℃下恒溫振蕩(120 r/min)。間隔多次取樣,每次取樣4 mL,然后再補充4 mL新鮮的PBS緩沖溶液。用紫外分光光度計測定427 nm處的吸收波長,再根據姜黃素在PBS緩沖溶液中的標準曲線計算姜黃素在不同時間下的釋放量。累計釋放量可根據式(2)計算:

式(2)

式中,Cn:第n次取樣時的濃度;Cn-1:第n-1次取樣時的濃度。

1.3 數據處理

每組數據均采用三組平行試驗得出平均值,采用Excel 2018進行數據計算與處理,并用軟件Origin 8.5進行作圖。

2 結果與分析

2.1 聚合物(R-St-mPEG)的制備

木薯淀粉作為天然淀粉的一種,溶解性也相對較差,所以在制備木薯淀粉基聚合物膠束時,選用二甲基亞砜作為反應溶劑。由木薯淀粉制備聚合物膠束,為避免多基團之間的相互反應,首先需要在淀粉分子骨架上引入疏水性基團。異丙基縮水甘油醚不僅是良好的疏水化試劑,同時也是溫度敏感性的功能基團,可以使得聚合物形成疏水性內核的同時使得淀粉基聚合物獲得溫度敏感性。反應在堿催化下遵循親核取代機理進行,淀粉在堿的催化下產生氧負離子,產生的氧負離子越多,親核取代也就越容易發生。其次,膠束的親水性外殼需要具有良好的生物相容性,聚乙二醇由于其突出的物化和生物性質(無毒、無抗原性和無免疫原性)使其在制備兩親性聚合物時常常被作為一種可溶性的聚合物改性劑,用其所制得的聚合物有很高的兩親性,生物相容性和生物可降解性。聚乙二醇的特性滿足作為負載膠束親水外殼這一要求。根據酯化反應機理,用羧基封端的聚乙二醇對淀粉進行親水基的修飾。最終得到產物R-St-mPEG。合成過程如圖1所示。

圖1 淀粉基聚合物(R-St-mPEG)的合成路線圖Fig.1 The synthetise of starch based polymer(R-St-mPEG)

2.2 聚合物結構表征

2.2.1 傅里葉紅外變換光譜(FTIR)結果分析 聚合物紅外光譜如圖2所示,由圖2中可以得知,與原淀粉(St)紅外圖相比,疏水淀粉(St-R)譜圖發生了新的變化。在1014～1160 cm-1出現新的寬強峰,這是縮水甘油醚接枝淀粉后的醚鍵的特征吸收峰[21]。1646和1465 cm-1兩處的吸收峰屬于C-H的彎曲振動[19]。3444 cm-1處的峰變強變寬,這是因為在淀粉分子鏈上引入縮水甘油醚后新增加的羥基所引起的。而與淀粉接枝縮水甘油醚(St-R)相比,疏水淀粉接枝聚乙二醇(R-St-mPEG)的紅外譜圖也出現了新的變化。1735 cm-1出現了羰基的特征吸收峰,這是羧基封端聚乙二醇接枝到淀粉上的重要標志。還有1110 cm-1處出現了明顯的酯鍵吸收峰[21]。此外,圖中2881～2977 cm-1之間的峰在不斷變寬變強,這是由于淀粉分子上引入了烷基類基團所導致的。這些證據都在一定程度上證明淀粉接枝聚合物(R-St-mPEG)的成功合成。核磁共振氫譜和紅外變換光譜相輔才能進一步證明聚合物的成功合成。

圖2 淀粉基聚合物(R-St、R-St-mPEG)及原淀粉(St)紅外光譜圖(FTIR)Fig.2 The infrared spectrum(FTIR)of starch-based polymer(R-St,R-St-mPEG)and starch(St)

2.2.2 核磁共振氫譜(1H-NMR)結果 利用核磁共振氫譜對聚合物的結構進行進一步表征,如圖3為淀粉基聚合物的核磁共振氫譜圖。由圖中則可以看出淀粉葡萄糖環(AGU)上各氫的質子峰都可以被明顯的觀察到,分別是5.6 ppm(20)、5.3 ppm(19)以及5.1 ppm(1)位置處的三個質子峰。除此之外,出現在化學位移δ=3.51和3.23 ppm處的質子峰分別歸屬于mPEG上的亞甲基和末端甲基,這些結果與文獻對照一致[22]。淀粉分子骨架上除了親水性的聚乙二醇(mPEG)之外,還引入了疏水性的縮水甘油醚,根據文獻可知[21,23],異丙基縮水甘油醚亞甲基中(H14,H15)的各質子峰出現在3.0～3.8 ppm之間,H17、H18出現在0.75 ppm附近,以及1.4和1.5 ppm附近的H16。這些證據都證明聚合物中接枝的各個基團都出現在了產物中,與紅外光譜中特征官能團的譜圖共同證明了聚合物(R-St-mPEG)的成功合成。

圖3 淀粉基聚合物(R-St-mPEG)的核磁共振氫譜圖(1H-NMR)Fig.3 Nuclear magnetic resonance spectrum ofstarch-based polymer(R-St-mPEG)

2.3 臨界膠束濃度(CMC)測定結果

臨界膠束濃度是證明膠束自組裝行為發生的重要參數,同時也能夠說明藥物載體在體內長效循環中的穩定性[24]。以芘做熒光探針,當芘從親水環境轉移到疏水環境的過程中,當聚合物濃度達到某個值的時候芘的熒光強度發生突變,這個濃度被定義為臨界膠束濃度(CMC)。如圖4所示,以芘的熒光強度比值(I318/I332)和聚合物濃度的對數(Log C)作圖,圖中拐點所示即為聚合物R-St-mPEG的臨界膠束濃度。拐點所對應的濃度為0.339 mg/mL。說明當聚合物膠束在溶液中的濃度達到0.339 mg/mL時,聚合物便能發生自組裝行為。疏水性基團向內卷曲形成疏水內核,親水性基團向外部排列形成親水性外殼。此外,臨界膠束濃度(CMC)的測定為聚合物膠束負載功能性物質提供了理論基礎,當膠束發生自組裝行為時,可以與姜黃素溶液混合,將姜黃素分子成功包裹進膠束的疏水內核中。

圖4 芘的熒光強度比值與膠束濃度對數圖Fig.4 Pyrene fluorescence intensity ratioand micelle concentration logarithm plot

2.4 聚合物(R-St-mPEG)透射電鏡(TEM)結果表征

透射電鏡可以對膠束的形貌進行表征,由于人體正常組織環境pH為7.4,所以為了保證膠束負載后進入體內能夠穩定輸送藥物,選用在pH7.4的磷酸緩沖液中對膠束分散后觀察其形貌。圖5所示為膠束在pH=7.4 PBS緩沖溶液中50 h后的形貌圖。由圖中可以看到,膠束呈現球形和橢球型結構,粒徑不均一。膠束在存放50 h后仍舊能夠保持球形結構,結構沒有發生坍塌或者破裂,這為后續膠束的負載提供了有利的穩定環境。負載膠束在進入人體后若是發生結構的坍塌或者破裂,將導致提前釋放和削弱膠束的緩釋效果。此外,透射電鏡結果也表明了通過自組裝行為形成了球形結構。

圖5 聚合物膠束的透射電鏡(TEM)圖Fig.5 TEM of polymer micelles

2.5 聚合物粒度分析

聚合物膠束作為藥物載體,其粒徑小于200 nm時,膠束能夠顯示出較好增強滲透性和滯留(EPR)效應[27]。通過馬爾文激光納米粒度散射儀可以測量聚合物膠束在溶液中粒徑,圖6所示為聚合物膠束在pH=7.4的緩沖溶液中的粒徑分布圖。粒徑集中分布在28和122 nm附近。粒徑分布不均一主要是聚合物基材淀粉的性質所導致的,淀粉本身粘度大,淀粉之間容易發生粘連[28],當淀粉分子之間發生粘連時,勢必會造成粒徑測量結果較大。此外,膠束的粒徑分布不均一與透射電鏡結果也相符,這也證明了實驗結果的正確性。

圖6 膠束的粒徑分布圖Fig.6 Particle size distribution of micelles

2.6 負載性能分析

為了獲得負載膠束中姜黃素的載藥量(DLC),稱取一定量負載有姜黃素的負載膠束溶解在DMSO中,利用紫外可見分光光度計測定波長在427 nm處的吸光強度,然后再通過姜黃素的標準曲線進行計算濃度,姜黃素在DMSO中標準曲線如圖7所示,標準曲線線性擬合良好。如圖8所示為不同投藥量膠束的載藥量,根據1.2.5.1中的式1計算可得,當材料投入100 mg,姜黃素投入量為14 mg時,膠束有最大負載量,負載量為18.47%。聚合物的投入量與藥物濃度之間有著密切的聯系,當藥物濃度較小時,膠束在形成時,藥物不能完全占據膠束的內核空間,導致負載量不能達到飽和。當逐步增大藥物濃度時,負載量呈現先增大后減小的趨勢,這是由于姜黃素在水中的穩定性較差[25],隨著DMSO不斷透析被除去,聚合物還未在水溶液中形成核-殼結構的膠束時,姜黃素便已經結晶析出,姜黃素發生聚集,導致負載量也隨著姜黃素濃度的增大而出現減小趨勢。所以聚合物材料的投加與藥物濃度之間需要有合適的比例。

圖7 姜黃素在DMSO中的標準曲線Fig.7 Standard curve of curcumin in DMSO

圖8 不同投藥量下的膠束負載量Fig.8 Micelle loads at different dosages

2.7 聚合物膠束的溫敏性能考察

人體內各組織之間的溫度也會存在一定的差異,腫瘤組織的溫度明顯高于人體正常體溫,這也為開發溫度敏感型的負載膠束提供了先決條件。溫度敏感型聚合物膠束的釋放機理主要與外界環境的溫度有關,當溫度高于聚合物的臨界溫度時,聚合物的結構和性質發生改變,導致膠束的核-殼結構收縮從而釋放。當溫度對于臨界溫度時,聚合物膠束分子上的羥基、氧、烷氧基等與溶液中的水分子形成氫鍵,膠束的核殼結構也會更加穩定,功能性物質姜黃素通過擴散和滲透作用[26]從膠束中進行釋放。根據上述機理,采用常溫和人體外環境溫度兩個條件下考察淀粉基聚合物R-St-mPEG的溫度敏感性和緩釋性能。首先繪制了姜黃素在磷酸緩沖液(PBS)中的標準曲線(如圖9),線性擬合度良好。間隔不用時間取樣,然后測定溶液的吸光度,根據式2計算負載膠束的累計釋放量,并以時間為橫坐標作圖(如圖10)。由圖中可以看出33 h以前,25 ℃環境中的膠束累計釋放量大于37 ℃環境中的累計釋放量,這是由于37 ℃環境中的負載膠束會經歷膠束球形結構收縮的過程,膠束更加緊密,導致藥物通過擴散和滲透方式釋放變慢。30～52 h之間,37 ℃環境中的膠束大于收縮更加緊密膠束中的藥物通過“擠出”方式釋放,產生突釋效應,累計釋放量變大。而25 ℃環境中的膠束一直處于平穩的釋放階段,沒有突釋階段,這也符合膠束通過擴散和滲透作用逐步釋放的機理。60 h內37 ℃環境中的膠束累計釋放量達到了43.9%,25 ℃環境中的負載膠束累計釋放量只有34.7%。負載膠束的累計釋放結果表明淀粉基聚合物R-St-mPEG具備溫度敏感性能,隨著溫度的升高釋放量也會不斷增加。

圖9 姜黃素在PBS緩沖液中的標準曲線Fig.9 Standard curve of curcumin in PBS buffer

圖10 負載膠束在不同環境中的釋放曲線Fig.10 Release curves of loadedmicelles in different environments

3 結論

本研究首先用異丙基縮水甘油醚改性木薯淀粉制備了疏水化淀粉R-St,然后用生物相容性好的親水性基團mPEG進行修飾,得到了一種新型兩親性的淀粉基聚合物R-St-mPEG。利用芘的熒光探針法表征了聚合物的自組裝行為,當聚合物膠束濃度達到0.339 mg/mL時,膠束能夠發生自組裝行為。利用透射電鏡進一步表征膠束的形貌,發現膠束結構呈現球形和橢球形。為了探明膠束的粒徑,利用馬爾文激光納米粒度散射儀對膠束粒徑進行測定,膠束粒徑集中分布在兩個區域,28和122 nm,與透射電鏡結果相符。此外,通過負載抗癌藥物姜黃素考察了膠束的負載性能,膠束與姜黃素之間需要合適的比例才能夠達到最大負載量,當膠束投加量為100 mg,姜黃素投加量為14 mg時,聚合物膠束具有最大負載量為18.47%。體外釋放結果表明聚合物膠束(R-St-mPEG)釋放是一個緩慢而穩定的過程,在溫度較高的條件下,聚合物膠束的釋放速度明顯較快,37 ℃環境中,膠束60 h內累計釋放量為43.9%,而在25 ℃環境中,60 h內膠束的累計釋放量為34.7%。證明聚合物膠束具有溫度響應性。本研究證明兩親性聚合R-St-mPEG膠束能夠有效包裹和釋放藥物,能夠成為有效的藥物載體。