引起肝膿腫的肺炎克雷伯菌毒力基因檢測(cè)及同源性分析

席健峰， 徐 義， 郭宇航， 李慧玲， 王 勇

1 佳木斯大學(xué)， 黑龍江 佳木斯 154007； 2 云臺(tái)山風(fēng)景名勝區(qū)云臺(tái)街道衛(wèi)生院， 江蘇 連云港 222000；3 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 黑龍江 佳木斯 154007

肝膿腫臨床主要表現(xiàn)為寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、乏力等。自1980年，在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)首次報(bào)道了由肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)引起的肝膿腫以來(lái)[1]，陸續(xù)在亞洲多個(gè)地區(qū)報(bào)道了有關(guān)KP引起的肝膿腫病例，顯然克雷伯菌屬已逐步成為亞洲地區(qū)細(xì)菌性肝膿腫的主要致病菌。這種引起肝膿腫的KP與普通的肺炎克雷伯菌(common Klebsiella pneumoniae,cKP)有很大的區(qū)別，其特點(diǎn)是菌落多呈黏液型(拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性)，主要引起侵襲性感染，如血流感染和化膿性肝膿腫，主要感染免疫功能正常的年輕個(gè)體[2-3]?；诖?，本研究對(duì)肝膿腫患者分離出的KP非重復(fù)菌株26株，檢測(cè)其血清型及毒力基因攜帶情況，并通過(guò)多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技術(shù)分析菌株同源性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2018年10月-2019年10月收治的肝膿腫患者分離出的KP非重復(fù)菌株26株和患者的臨床資料。標(biāo)本類型是血液和膿汁。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、沙門(mén)氏菌H9812和肺炎克雷伯ATCC700603均購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。菌株納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)通過(guò)B超或CT等影像設(shè)備發(fā)現(xiàn)肝膿腫；(2)B超引導(dǎo)下抽取膿汁或抽取患者血液等標(biāo)本送微生物培養(yǎng)確認(rèn)；(3)通過(guò)全自動(dòng)微生物分析儀鑒定是KP。

1.2 儀器與試劑 Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀(法國(guó)梅里埃公司)，PCR儀 (S1000TMThermal Cycler，美國(guó)BIO-RAD公司)，電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，凝膠成像分析系統(tǒng) (Tocan，上海領(lǐng)成生物科技有限公司)。血平板、麥康凱平板(英國(guó)OXOID公司)，核酸提取試劑盒(重慶中元生物技術(shù)公司)，PCR試劑盒(上海生物科技公司)。

1.3 拉絲試驗(yàn) 在含5%羊血瓊脂平板上接種菌株，然后置于37 ℃、CO2恒溫孵箱培養(yǎng)18 h后，用滅菌接種環(huán)輕輕放于菌落上并慢慢向上提起接種環(huán)，如果提起接種環(huán)過(guò)程中出現(xiàn)絲狀物且長(zhǎng)度≥5 mm，為拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性；反之，則為陰性[4]。拉絲試驗(yàn)和rmpA基因同時(shí)陽(yáng)性可判讀為高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP)[5]。

1.4 PCR法檢測(cè)毒力基因 用磁珠法提取細(xì)菌的模板DNA，參照表1委托上海生工生物有限公司合成KP的血清型如K1、K2、K3、K5、K16、K20、K54、K57和毒力基因如magA、 rmpA、uge、kfu、wcaG、aero、iroNB、allS、mrkD、kpn、fimH、iucB、ureA、cf29a，PCR總反應(yīng)體系25 μl：Go Taq?Green Master Mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板1 μl，ddH2O 9.5 μl。陽(yáng)性產(chǎn)物由上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上運(yùn)用BLAST比對(duì)確定其基因型。

1.5 MLST分析結(jié)果 選取KP的7個(gè)管家基因gapA、mdh、pgi、infB、rpoB、tonB、phoE進(jìn)行擴(kuò)增,引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件參照http://www.pasteur.fr/公布的數(shù)據(jù)。擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序，結(jié)果上傳至數(shù)據(jù)庫(kù)http://bigsdb.pasteur.fr進(jìn)行比對(duì)分型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher’s確切檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 26例肝膿腫患者中，男17例，女9例。年齡27～84歲，平均61.4歲，年齡在60歲以上占57.7%(15/26)。其中20例患者有糖尿病病史。這些患者均表現(xiàn)出不同程度的寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、乏力等癥狀。膿腫有21例發(fā)生于肝右葉，占80.8%,臨床治愈/好轉(zhuǎn)占92.3%(24/26)。

2.2 菌株來(lái)源及耐藥情況 26株引起肝膿腫的KP分離自血液和膿汁各占13株。源于普外科和感染科的標(biāo)本明顯高于其他科室(P值均<0.05)，且這兩科室差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。菌株標(biāo)本各科室來(lái)源分布見(jiàn)表2。這26株菌對(duì)臨床常用的抗菌藥物如頭孢呋新、頭孢呋辛酯的敏感率達(dá)80.8%(21/26)；對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁、頭孢他啶的敏感率達(dá)88.5%(23/25)；對(duì)哌拉西林/他唑巴坦的敏感率為92.3%(24/26)；對(duì)頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、左旋氧氟沙星、復(fù)方新諾明、厄他培南、亞胺培南等藥物敏感率達(dá)到100%。檢測(cè)到一株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，為K2血清型且是黏液型菌落，MLST分析結(jié)果為ST86型。

表2 菌株標(biāo)本類型來(lái)源科室分布

2.3 拉絲試驗(yàn)鑒定 26株KP經(jīng)拉絲試驗(yàn)鑒定，陽(yáng)性率達(dá)100%，rmpA攜帶率也為100%。根據(jù)hvKP的判斷標(biāo)準(zhǔn)，這26株KP均為hvKP。

2.4 菌株的血清型及毒力基因攜帶情況 通過(guò)PCR檢測(cè)本研究26株hvKP共檢測(cè)出4種血清型，分別是K1(17株)、K2(5株)、K5(1株)、K57(1株)，未知血清型2株。未檢測(cè)到K3、K16、K20、K54。毒力基因攜帶結(jié)果顯示rmpA+aero+ureA這3種毒力基因攜帶率達(dá)100%(表3)。毒力基因共檢測(cè)出了13種，分別是rmpA、aero、uge、magA、wcaG、mrkD、fimH、kfu、allS、kpn、iroNB、iucB、ureA，未檢測(cè)出cf29a(圖1、2)。

表3 hvKP莢膜血清型及毒力基因攜帶情況[例(%)]

表1 莢膜血清型及毒力相關(guān)基因引物序列

注：M，Marker；1～6孔道分別是K1、K2、K5、K57、iucB、ureA。

圖1hvKP血清型及毒力基因電泳圖

注：M，Marker；1～11孔道分別是rmpA、aero、uge、wcaG、magA、allS、kfu、fimH、mrkD、kpn、iroNB。

圖2hvKP毒力基因電泳圖

2.5 MLST分析結(jié)果 MLST分析發(fā)現(xiàn)17株K1血清型均為ST23型；K2血清型有3株是ST86型，2株是ST65型；1株K5血清型為ST485型；1株K57血清型為ST592型；剩余兩株是ST1934型。

3 討論

近年來(lái)，由KP引起的肝膿腫逐年遞增[6]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)引起肝膿腫的KP主要來(lái)源于兩方面:(1)源于腸道,定植于腸道的細(xì)菌可通過(guò)侵入腸黏膜進(jìn)入門(mén)靜脈，逆行感染肝臟從而引起肝膿腫；(2)源于血液，有關(guān)報(bào)道[7]認(rèn)為，中性粒細(xì)胞吞噬了hvKP可隨著血流進(jìn)入肝臟，繼而形成肝膿腫，血液中的hvKP能夠抵制血清對(duì)細(xì)菌的滅活和其他吞噬細(xì)胞的吞噬作用，經(jīng)動(dòng)脈入肝臟后，易于停留，從而引起肝膿腫。本研究表明KP所引起的肝膿腫多發(fā)于肝右葉，占80.8%(21/26)，多見(jiàn)于60歲以上的患者，與有關(guān)文獻(xiàn)[8]相符。本研究納入的肝膿腫患者76.9%(20/26)有糖尿病病史，據(jù)臨床研究[9]證實(shí)糖尿病是細(xì)菌性肝膿腫的重要危險(xiǎn)因素，本研究與之相符。

黏液表型是hvKP特征之一，本實(shí)驗(yàn)所分離的肝膿腫KP 100%為高黏液型菌株，主要為K1、K2血清型，占全部菌株的84.6%，與近5年來(lái)國(guó)內(nèi)外的分布情況相符[10]，K1檢出率為65.4%，比有關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道的42.9%高一些。本實(shí)驗(yàn)K1、K2血清型菌株毒力攜帶情況明顯高于其他血清型。據(jù)相關(guān)研究[12]證實(shí)K1、K2血清型菌株毒力明顯強(qiáng)于其他血清型，在對(duì)健康人血清的抵抗及抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬方面明顯強(qiáng)于非K1、K2型，本實(shí)驗(yàn)與之相符。

本實(shí)驗(yàn)菌株攜帶的毒力基因主要分為四類：(1)與莢膜多糖有關(guān)的毒力基因如wcaG、magA、rmpA、ureA；(2)與細(xì)菌的定植和菌毛黏附有關(guān)的毒力基因如fimH、mrkD、allS、kpn；(3)與細(xì)菌脂多糖有關(guān)的毒力基因如uge；(4)與鐵載體有關(guān)的毒力基因如iucB、aero、kfu、iroNB。通過(guò)K1、K2血清型對(duì)比可知magA、wcaG、allS、kfu這4種毒力基因在K2血清型中并未表達(dá)，而毒力基因kpn在K1血清型中未表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道allS和kfu這兩種毒力基因僅表達(dá)于K1型菌株中，并未在非K1型菌株中表達(dá)。allS的表達(dá)與本實(shí)驗(yàn)相符，但kfu這種毒力基因不僅在K1血清型中表達(dá)，還表達(dá)于其他未知血清型中。本實(shí)驗(yàn)中magA、wcaG 這兩種毒力基因是K1血清型所獨(dú)有的，據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道黏液相關(guān)基因(magA)與hvKP的莢膜合成有關(guān)，但magA基因僅存在于K1型菌中，編碼特異性的聚合酶(wzy-K1)參與莢膜合成，這一結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)相符。在本實(shí)驗(yàn)菌株中rmpA毒力基因攜帶率達(dá)100%，且均為高黏液型。據(jù)文獻(xiàn)[15]報(bào)道rmpA被認(rèn)為是KP黏液表型形成基因，在KP黏液形成過(guò)程中起到重要的作用，無(wú)論是位于染色體上的rmpA基因，還是位于質(zhì)粒上的rmpA和rmpA2基因，都能夠編碼RmpA/RmpA2蛋白，參與KP黏液表型的調(diào)控，這一特性與本研究相符。本實(shí)驗(yàn)fimH、mrkD這兩種菌毛黏附相關(guān)基因攜帶率為100%。Ⅰ型菌毛是細(xì)菌表面上的線狀突起，由fimA-H基因編碼，Ⅲ型菌毛是螺旋狀的細(xì)絲，在KP中由mrkABCD基因簇編碼，有研究[16]稱無(wú)論是hvKP還是cKP均存在Ⅰ型和Ⅲ型菌毛，但也有mrkD基因只在hvKP中檢出的報(bào)道,并與K2血清型密切相關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)菌株皆為hvKP，是否在cKP也存在這兩種毒力基因有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)顯示mrkD在各種血清型中均高表達(dá)，并未體現(xiàn)與K2血清型密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中K1血清型菌株均為ST23序列型, K2血清型主要屬于ST86和ST65序列型，這與相關(guān)文獻(xiàn)[17]報(bào)道相符。

hvKP除了對(duì)氨芐西林天然耐藥外，對(duì)臨床常用的抗菌藥物敏感性高。然而，隨著碳青霉烯酶的水平傳播，已經(jīng)出現(xiàn)了碳青霉烯耐藥的高毒力肺炎克雷伯菌(cr-hvKP)[18]。本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的hvKP比率為3.8%(1/26)，并未發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌和cr-hvKP。雖然本院當(dāng)前hvKP的耐藥率低，但是科研人員和臨床醫(yī)生都應(yīng)密切關(guān)注hvKP的耐藥趨勢(shì)。

綜上所述，通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解肝膿腫KP莢膜血清型及毒力基因攜帶情況，且對(duì)這些菌株進(jìn)行同源性分析，有助于臨床更加深入的了解hvKP，從而給出最佳的治療方案。