四川地區不同疾病譜慢性HBV感染者病毒基因分型與細胞免疫及凝血功能的關系

李守娟， 王 麗， 陳 竹， 胡朝霞， 王 磊， 吳 蓓， 朱 麗， 段 萌

成都市公共衛生臨床醫療中心 肝病科， 成都 610066

Association of genotype with cellular immunity and coagulation function in chronic hepatitis B virus infection patients with different disease spectrums in Sichuan, China

LIShoujuan,WANGLi,CHENZhu,etal.

(DepartmentofHepatology,ChengduPublicHealthMedicalCenter,Chengdu610066,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the genotype distribution of chronic hepatitis B virus (HBV) infection patients with different disease spectrums in Sichuan, China, as well as the association of genotypes with cellular immunity and coagulation function.MethodsA total of 543 patients with chronic HBV infection who were hospitalized in Chengdu Public Health Medical Center from January 2015 to June 2017 were enrolled, among whom there were 31 chronic HBV carriers, 285 patients with chronic hepatitis B (CHB), 77 patients with severe hepatitis B, 81 patients with hepatitis B cirrhosis, and 69 patients with hepatocellular carcinoma (HCC). Blood samples were collected; gene microarray was used to determine the genotypes of HBV DNA, and T lymphocyte subsets and coagulation function were measured. An analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the SNK-qtest was used for further comparison between two groups; the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups.ResultsAmong the 543 patients with chronic HBV infection, 400 (73.66%) had type B infection, 123 (22.65%) had type C infection, 10 (1.84%) had mixed type B and C infection, and 10 (1.84%) had mixed type C and D infection. There were no significant differences in the distribution of HBV genotypes, prothrombin time, and prothrombin activity in different disease spectrums between the patients with type B infection and those with type C infection (allP>0.05). According to the results of T lymphocyte subsets, in the severe hepatitis B group, the patients with type C infection had higher percentages of CD3+and CD3+CD4+T cells than those with type B infection; in the chronic hepatitis B group, the patients with type C infection had a higher percentage of CD3+CD8+T cells than those with type B infection; in the chronic HBV carrier group, severe hepatitis B group, and hepatitis B cirrhosis group, the patients with type C infection had a higher CD4+/CD8+ratio than those with type B infection; in the hepatitis B cirrhosis group, the patients with type C infection had lower percentages of CD3+, CD3+CD4+, and CD3+CD8+T cells than those with type B infection; in the HCC group, the patients with type C infection had lower percentages of CD3+, CD3+CD4+, and CD3+CD8+T cells and a lower CD4+/CD8+ratio than those with type B infection, with significant differences in the percentages of CD3+CD4+T cells (t=2.078,P=0.041) and CD3+CD8+T cells (t=6.672,P<0.001) between the patients with type C infection and those with type B infection in the hepatitis B cirrhosis group.ConclusionTypes B and C are the main genotypes of chronic HBV infection in different disease spectrums in Sichuan, with type B more commonly seen than type C, and there is no difference in the distribution of HBV genotypes between patients with different disease spectrums. Disorder of cellular immune function is observed in patients with chronic HBV infection, with different immune disorders in different stages of infection, and the genotype of infection is not associated with coagulation function and cellular immune function.

Keywords：hepatitis B virus; genotype; immunity, cellular; blood coagulation; Sichuan

HBV感染機體后主要通過宿主免疫機制引起肝損傷，造成HBV感染后不同臨床轉歸的原因有病毒、環境因素、宿主遺傳因素等[1]，不同的病毒基因型可能影響抗原表達而產生不同的臨床表現，具有不同的流行特征及致病性。肝臟在凝血機制中占有極其重要的地位，凝血因子合成能力反映了肝細胞的功能狀態。國外學者Sass等[2]認為凝血時間是判斷重型肝炎預后的重要因素。不同疾病譜慢性HBV感染者基因型是否導致機體免疫功能的差異及凝血功能的改變，臨床報道不多。本研究通過對四川地區慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝細胞癌患者的基因型和T淋巴細胞及凝血功能變化進行分析，以探討不同基因型與細胞免疫及凝血功能的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月-2017年6月于本院住院的四川地區(宜賓、巴中、廣安、廣元、成都、甘孜州、阿壩州)HBV感染者。根據患者癥狀、體征、實驗室及影像學檢查結果，將患者分為慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化以及肝細胞癌(在慢性乙型肝炎基礎上發生的肝細胞癌)5組，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[3]。納入患者均進行HBV DNA基因分型以及T淋巴細胞亞群和凝血功能檢測。排除甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、HIV、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、藥物性、代謝性等疾病。患者均簽署知情同意書。

1.2 HBV DNA基因分型檢測 采用基因芯片法，使用珠海賽樂奇生物技術有限公司提供的儀器及配套試劑盒，將待測不同HBV基因型的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成檢測芯片，從患者血清中抽提出的HBV DNA經PCR擴增標記后與芯片進行雜交，雜交信號由掃描儀掃描，再經計算機分析確認結果。嚴格按照試劑盒上說明進行操作。

1.3 T淋巴細胞亞群檢測 使用BECKMAN FC500流式細胞儀及配套試劑檢測T淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8：每個樣品測定管中加入50 μl抗凝血(EDTA-K2抗凝)，各管加入10 μl三色單抗，輕微振蕩混勻，室溫避光放置20 min；加1 ml溶血素裂解紅細胞，輕微振蕩，避光10 min，接著離心棄上清2次，加PBS后上機檢測。取50 μl全血加10 μl IgG1-FITC/IgG1-PE/IgGl-PE-Cy5(小鼠)，作為陰性對照，其他步驟同上。每份標本測定5000個細胞，全部數據用流式細胞儀和軟件SYSTEM Ⅱ獲取及分析。

1.4 肝功能及凝血功能測定 采用Labospect 008全自動生化分析儀和邁克生物生化試劑檢測肝功能各項指標，包括ALT、AST、Alb、TBil。通過Sysmex CS-2000血凝儀及武漢中太生物技術有限公司血凝試劑進行PT、凝血酶原活動度(PTA)檢測。

2 結果

2.1 一般資料 共納入543例HBV感染者，年齡18～70歲，平均(41.25±13.67)歲，其中男416例，女127例。納入患者中慢性HBV攜帶者31例，慢性乙型肝炎(包括輕、中、重度)285例，重癥乙型肝炎(包括早、中、晚期)77例，乙型肝炎肝硬化81例，肝細胞癌69例。其中B型400例，占73.66%；C型123例，占22.65%；B、C混合型10例(漢族)，C、D混合型10例(漢族4例，藏族6例)，各占1.84%。各組均以B型、C型常見，B型為主，可見極少部分B、C混合型及C、D混合型，沒有發現A、E、F、G、H、I、J型(表1)。

表1 不同類型HBV感染者的基因分型情況[例(%)]

2.2 B/C不同基因型慢性HBV感染者肝功能測定 因B、C混合型及C、D混合型例數較少，故僅選取B型和C型共523例慢性HBV感染者進行肝功能測定。慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化以及肝細胞癌各組中HBV基因型的分布無差異(χ2=8.770，P=0.067)。肝功能檢測結果顯示，各組內B型與C型患者比較，慢性乙型肝炎組Alb(t=2.073，P=0.039)、乙型肝炎肝硬化組ALT(t=2.851，P=0.006)和AST(t=3.182，P=0.002)水平差異均有統計學意義，其余指標組內比較均無統計學差異(P值均>0.05)。同一基因型不同分組間肝功能比較顯示，B基因型中慢性HBV攜帶者ALT、AST、TBil、Alb水平與其他組差異均有統計學意義(P值均<0.05)；B/C基因型中，重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組、肝細胞癌組比較，ALT、AST、TBil水平差異均有統計學意義(P值均>0.05)；而乙型肝炎肝硬化組與肝細胞癌組各項肝功能指標比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表2)。

2.3 B/C不同基因型慢性HBV感染者凝血及T淋巴細胞亞群測定 各組內B型與C型患者比較，僅乙型肝炎肝硬化組CD3+CD4+(t=2.078，P=0.041)、CD3+CD8+(t=6.672，P<0.001)差異有統計學意義，其余指標組內比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)。同一基因型不同組間凝血功能檢測結果顯示，慢性乙型肝炎組與重癥乙型肝炎組、重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組和肝細胞癌組相比，PT、PTA差異均有統計學意義(P值均<0.05)；而慢性HBV攜帶者與慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者與肝細胞癌患者凝血功能比較均無差異(P值均>0.05)。同一基因型不同組間T淋巴細胞亞群檢測結果顯示，B基因型中慢性乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細胞癌組、重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/ CD8+差異均有統計學意義(P值均<0.05)，且乙型肝炎肝硬化患者CD3+CD8+數量明顯高于肝細胞癌患者(P<0.05)。C基因型中慢性HBV攜帶者與重癥乙型肝炎組、乙型肝炎肝硬化組及肝細胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+數量差異均有統計學意義(P值均<0.05)，重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+數量差異亦均有統計學意義(P值均<0.05)；慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎3組分別與乙型肝炎肝硬化組和肝細胞癌組比較，CD3+CD8+數量差異均有統計學意義(P值均<0.05)；CD4+/CD8+各組間比較均無統計學差異(P>0.05)(表3)。

3 討論

目前根據HBV全基因序列差異>8%或S基因片段差異>4%分為A～J共10個基因型[4]。HBV基因型分布具有明顯的地域特征，在我國主要是B型和C型[5-6]，也存在A型、D型及B和C型混合感染[7]。胡朝輝等[8]報道四川地區HBV基因型以B、C型為主，而B型占優勢地位。本研究結果顯示，納入543例HBV感染者中B型占73.66%，C型占22.65%，B、C混合型及C、D混合型各占1.84%，沒有發現A、E、F、G、H、I、J型。筆者對523例B/C不同基因型各疾病譜慢性HBV感染者進行比較，發現各組中HBV基因型的分布無差異，肝功能檢測中慢性乙型肝炎組Alb，乙型肝炎肝硬化組ALT、AST比較差異有統計學意義，表明在HBV導致的有明顯肝臟炎癥及纖維化程度較重的肝臟疾病譜中，B型比C型更易引起炎癥反應，但C型患者肝臟合成能力較差。同一基因型各疾病譜間比較結果顯示，B基因型中慢性HBV攜帶者與各組比較肝功能指標均有差異(P值均<0.05)；B/C基因型除Alb外，其余指標在重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組、肝細胞癌組比較中差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而乙型肝炎肝硬化組與肝細胞癌組各項指標差異無統計學意義(P值均>0.05)，表明在HBV所致肝細胞壞死程度與引起不良臨床結局方面B與C基因型之間無差異。

表2 B/C不同基因型慢性HBV感染者肝功能檢測結果

注：與慢性HBV攜帶者比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05；與重癥乙型肝炎組比較，3)P<0.05。

表3 B/C不同基因型慢性HBV感染者凝血功能及T淋巴細胞亞群檢測結果

組別例數CD3+CD4+(個/μl)B型C型CD3+CD8+(個/μl)B型C型CD4+/CD8+B型C型慢性HBV攜帶者31746.11±78.09734.25±61.87409.93±68.58365.50±40.911.85±0.242.02±0.10慢性乙型肝炎278577.20±204.631)554.97±150.411)401.43±179.54420.21±217.741.57±0.521.50±0.52重癥乙型肝炎75485.27±180.021)2)500.19±114.991)309.13±205.951)2)292.10±123.791.90±0.751.94±0.75乙型肝炎肝硬化77377.19±243.581)2)3)266.96±131.941)2)3)223.09±159.631)2)3)135.45±2.511)2)3)2.15±1.202)3)2.28±2.02肝細胞癌62313.00±124.421)2)3)306.00±54.041)2)3)152.23±54.341)2)3)4)144.33±23.401)2)3)2.19±0.912)3)2.14±0.32F值34.17031.92329.16631.52312.2873.436P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.0010.369

注：與慢性HBV攜帶者比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05；與重癥乙型肝炎組比較，3)P<0.05；與乙型肝炎肝硬化組比較，4)P<0.05。

肝臟是合成凝血因子的主要場所。隨著肝損傷程度的加重，慢性乙型肝炎患者凝血功能有降低的趨勢，特別是對于慢性重型乙型肝炎患者和肝硬化患者[9]。肝病患者凝血因子的變化對合理判斷預后具有重要參考價值[10]。本研究發現，同一基因型不同疾病譜間比較，隨著肝損傷的加重，PT延長，PTA降低，尤其是重癥乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者更明顯，與上述研究[9]結果一致。而同一疾病譜內B基因型患者PT延長及PTA降低程度雖比C基因型患者明顯，但均無統計學差異(P值均>0.05)。

外周血T淋巴細胞的數量、功能和各亞群構成比的變化反映了機體的細胞免疫狀態。HBV感染后，患者主要依靠機體細胞毒效應與非細胞毒效應兩種免疫機制清除病毒。其中T淋巴細胞參與的細胞毒效應起主導作用。研究[11]顯示慢性乙型肝炎患者存在細胞免疫功能紊亂。本研究中，各疾病譜內CD3+、CD3+CD4+數量在重癥乙型肝炎組，CD3+CD8+數量在慢性乙型肝炎組，CD4+/CD8+在慢性HBV攜帶者組、重癥乙型肝炎組及乙型肝炎肝硬化組C型均高于B型，而乙型肝炎肝硬化組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+數量與肝細胞癌組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+數量、CD4+/CD8+則是C基因型患者低于B型，且僅乙型肝炎肝硬化患者CD3+CD4+、CD3+CD8+數量比較差異有統計學意義(P值均<0.05)，說明肝硬化患者C型較B型CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞受損嚴重，以致其免疫功能更低下[12]。同一基因型不同疾病譜間比較結果顯示，B基因型中隨著病情的加重，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+數量逐漸減少，CD4+/CD8+僅慢性乙型肝炎組低于慢性HBV攜帶者，其余各組均高于慢性HBV攜帶者且逐漸上升，其中慢性乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細胞癌組比較、重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+數量和CD4+/CD8+差異均有統計學意義(P值均<0.05)，且乙型肝炎肝硬化組與肝細胞癌組CD3+CD8+數量比較差異亦有統計學意義(P值均<0.05)，說明在慢性HBV感染的過程中，機體的免疫細胞在清除病毒過程中造成自身不同程度損耗，致使患者免疫力低下，可能會進一步促發乙型肝炎肝硬化狀態下的肝細胞惡變[12]。C基因型中，肝細胞癌組CD3+、CD3+CD4+數量高于乙型肝炎肝硬化組，其余各組隨病情的進展逐漸減少但均高于肝細胞癌組；慢性HBV攜帶者分別與重癥乙型肝炎組、乙型肝炎肝硬化組及肝細胞癌組比較，重癥乙型肝炎組分別與乙型肝炎肝硬化組、肝細胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+數量差異均有統計學意義(P值均<0.05)；CD3+CD8+數量變化從大到小依次為：慢性乙型肝炎>慢性HBV攜帶者>重癥乙型肝炎>肝細胞癌>乙型肝炎肝硬化，且慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎3組分別與乙型肝炎肝硬化和肝細胞癌組比較，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而CD4+/CD8+變化順序為：乙型肝炎肝硬化>肝細胞癌>慢性HBV攜帶者>重癥乙型肝炎>慢性乙型肝炎，但各疾病譜間比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)。說明在慢性HBV感染的不同階段，機體的免疫紊亂各不相同[12]。

綜上所述，四川地區不同疾病譜慢性HBV感染者基因分型以B型、C型常見，B型為主；各疾病譜中B、C基因型的分布無差異。同一基因型不同疾病譜間比較，隨著肝損傷的加重，PT延長，PTA降低，尤其是重癥乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者更為明顯，同一疾病譜內B基因型PT延長及PTA降低程度雖比C型明顯，但均無統計學差異(P值均>0.05)。在慢性HBV感染者體內存在細胞免疫功能的紊亂，且隨感染的不同階段，機體的免疫紊亂各不相同，除乙型肝炎肝硬化患者C型較B型CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞受損嚴重有統計學意義，其余各組CD3+、CD4+/CD8+組內比較均無統計學差異，提示HBV基因型是否可導致不同疾病譜慢性乙型肝炎患者細胞免疫功能的差異有待進一步研究。