實時熒光定量PCR技術在白酒釀造過程中微生物數量檢測的應用展望

程平言，路 虎，胡 峰，涂華彬

（貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州習水 564622）

實時熒光定量PCR 技術于1996 年由美國Applied Biosystems 公司開發，相對于傳統PCR 技術，該技術實現了PCR 從定性到定量的質的飛躍，而且比傳統PCR 技術具有更強的特異性，靈敏度高等優點，更由于其在定量方面的準確性和自動化程度高等特點，已在分子生物學領域得到廣泛的應用[1]。但是，目前為止，實時熒光定量PCR 技術在白酒釀造過程中微生物檢測方面的研究較少，而采用傳統微生物計數的方法并不能真實有效的反映發酵體系中微生物的種類和數量。如若采用實時熒光定量PCR 的方法，則可以實時、快速、簡便的對發酵體系中的微生物進行跟蹤檢測。

1 實時熒光定量PCR 的原理

實時熒光定量PCR 技術，是指在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的累積實時監測PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[2]。在熒光定量PCR 中，有一個很重要的參數：Ct 值。C 是Cycle 的縮寫，t 是threshold 的縮寫，Ct值的意義是反映管內的熒光信號達到所設定閾值時經過的循環數。經研究[3]表明，每個模板的Ct 值與該模板的起始拷貝數的對數呈現線性關系，起始拷貝數越大，Ct 值越小。如此便可以通過已知起始拷貝數的標準品建立熒光定量PCR的標準曲線。這樣檢測到未知濃度的基因組的Ct值，通過標準曲線就可以推算該基因組的起始濃度。

2 熒光檢測方法

目前最常用于熒光信號檢測的一般可分為3種類型：

一是熒光染料的方法，目前熒光染料應用最廣泛的是SYBR GreenⅠ，在實時熒光定量PCR 反應體系中，添加過量的SYBR GreenⅠ染料，它能特異性的結合到DNA 雙鏈的小溝上從而產生熒光信號[4]，沒有結合雙鏈的SYBR GreenⅠ 是不產生熒光信號的。添加熒光染料進行熒光檢測的方法最大的特點是簡單易操作，但是由于SYBR GreenⅠ 能結合到所有DNA 的雙鏈上，如果PCR 反應體系中出現非特異性擴增，此方法的定量準確性就會降低。不過，我們可以通過實時熒光定量PCR 的一些分析軟件查看最后PCR 產物的溶解曲線來進行分析。

二是雙標記探針法，此方法的原理是通過標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物。目前在此方法體系中應用最廣泛的為TaqMan探針。TaqMan 探針也是一寡核苷酸，其5'端標記一個報告熒光基團，3'端標記一個淬滅基團。當此探針不結合到DNA 上時，檢測不到5'端熒光基團所發出的熒光[5]。但是當PCR 褪火時，引物與探針開始與模板結合，此時5'端熒光基團將會脫離出來進入到反應體系中，由于不再受到3'端淬滅基團的干擾，從而可以產生熒光信號，進而能被儀器檢測到。此方法中，每結合一個模板就會有一個熒光信號產生，就能實現PCR 過程的實時檢測。

三是分子信標法，分子信標指的是一種形成發夾結構的探針，呈現發夾結構時，報告熒光基團產生的熒光信號被淬滅基團屏蔽，當探針與模板結合時，發夾結構打開，呈現一種線性結構，進而報告熒光基團與淬滅基團的物理距離增加，熒光信號不再屏蔽[6-7]，進而可以被檢測到。

雙標記探針法和分子信標法原理[8]如圖1所示。

3 待擴增序列的選擇

PCR 的擴增序列一般從兩方面來考慮：一方面是從16S rDNA[9]，一方面是從功能基因[10]。16S rDNA 上一般含有穩定的保守序列，其含量的多少可以用來表征某一類微生物的基因組含量。目前擴增16S rDNA 應用比較廣泛，在土壤微生物、食品微生物、醫學等方面都得到極大的應用[11-12]。功能基因是指某一類微生物具有相同的化合物的合成生理特性，而具有相同的功能基因序列[13]，所以也可以對其功能基因進行定量來表征某一類微生物的基因組含量。

4 基因組提取方法

根據是否在提取基因組前將微生物從環境中分離出來，可分為原位破碎和異位破碎[14-15]。原位破碎是指直接對環境中的微生物進行細胞破碎，進而進行分離純化。異位破碎是指先將微生物從環境中分離出來，再進行細胞破碎，進而提取微生物基因組。

無論是原位破碎還是異位破碎，目的都是要將環境微生物細胞壁破碎，進而對基因組進行分離和純化。破壁方法[16-18]目前應用較多的就是溶菌酶破碎、玻璃珠破碎、液氮研磨破碎等。

一般原位破碎法比異位破碎法提取到的基因組濃度要高。作者曾經對大曲中微生物基因組提取方法進行研究，結果如2 圖所示。

從圖2 可以明顯看出，異位破碎方法提取到的基因組濃度明顯要低于原位破碎法。雖然異位破碎法得到的基因組濃度較低，但是所得基因組純度卻是最高的。對所得基因組進一步進行熒光定量PCR 實驗，分析擴增效率，若是基因組純度對擴增效率影響不大，則可以選擇原位破碎法進行大曲微生物基因組提取。

5 實時熒光定量PCR 在白酒釀造過程中的應用前景

白酒釀造過程中微生物種類復雜多樣，并且不同微生物的數量也是在不斷變化的。有研究表明，采用傳統可培養的方法能檢測到的環境微生物僅占總體的1%左右[19]。如果采用傳統微生物的研究方法不能及時有效的反映出白酒釀造過程中不可培養微生物的種類和數量的變化，而采用實時熒光定量PCR 的方法則可能會得到理想的結果。采用實時熒光定量PCR 方法的局限在于必須明確所要研究微生物的待擴增序列[20]，進而進行引物設計，而白酒釀造過程中微生物種類復雜，想要明確所有微生物的擴增模板，尚存在困難。但是，隨著分子技術及手段的不斷發展，這些問題都能夠得到解決。相信在將來，實時熒光定量PCR 技術在白酒微生物檢測方面將會得到廣泛應用。