不同包埋量固定化酵母對(duì)黃酒發(fā)酵及風(fēng)味的影響

徐岳正，王晶晶，蔣予箭，李智慧，2，周建弟，2

（1.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312000；2.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興 312000；3.浙江工商大學(xué)食品與生物技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310012）

固定化技術(shù)是用物理或化學(xué)方法將游離的酶或細(xì)胞限定在一定的空間區(qū)域，既能保持本身活性，又能連續(xù)反應(yīng)之后回收和反復(fù)利用[1]。傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵用游離細(xì)胞發(fā)酵，酵母隨發(fā)酵液不斷流失，使發(fā)酵罐中酵母濃度不夠，造成酒精發(fā)酵速度慢，時(shí)間長(zhǎng)，使用發(fā)酵罐多；采用固定化酵母發(fā)酵，細(xì)胞濃度大，發(fā)酵速度快[2]。有外國(guó)學(xué)者[3]研究發(fā)現(xiàn)，如果選擇合適的載體固定酵母進(jìn)行發(fā)酵，與游離酵母相比，酯醇比會(huì)更高，有利于形成果香和提高風(fēng)味。

固定化技術(shù)已運(yùn)用于酒精、白酒、葡萄酒、啤酒及果酒的生產(chǎn)，如固定化技術(shù)應(yīng)用于啤酒中能明顯縮短主發(fā)酵、后發(fā)酵時(shí)間[4]，也可用于生產(chǎn)低醇或無(wú)醇啤酒[5-6]。酵母菌對(duì)黃酒發(fā)酵有重要作用，它的發(fā)酵副產(chǎn)物是黃酒中香氣物質(zhì)的重要來(lái)源[7]。在固定化條件下，酵母菌改變了自身存在方式，酵母菌的生存、增殖、發(fā)酵不僅受到發(fā)酵液的環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的影響，還受到固定化體系、載體傳質(zhì)阻力、載體中其他酵母的影響。

本文研究在固定化條件下酵母包埋量對(duì)黃酒發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)和香氣物質(zhì)生成量的影響，尋找合適的酵母包埋量，為固定化酵母替代傳統(tǒng)游離酵母發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

糯米，購(gòu)于超市；液化酶、糖化酶、麥曲，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供；釀酒酵母，安琪黃酒專用活性干酵母，市售。

耗材及試劑：葡萄糖、海藻酸鈉、氯化鈣、消泡劑、硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、鹽酸、甲基紅、無(wú)水乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。正丙醇，異丁醇，異戊醇，苯甲醛，乙醛，β-苯乙醇，乳酸乙酯，乙酸乙酯，均為分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.9%(GC)，乙酸(＞99%)，均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

儀器設(shè)備：HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；TG16-WS 型臺(tái)式高速離心機(jī)，滄州路儀實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；25×16 型血球計(jì)數(shù)板，泰州市育才教學(xué)設(shè)備有限公司；血球計(jì)數(shù)板，泰州市育才教學(xué)設(shè)備有限公司；44X3 型生物顯微鏡，上海光學(xué)儀器一廠；PHS-3C 型酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；ZNCL-BS 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，上海越眾設(shè)備儀器有限公司；GC-2014C 型氣相色譜儀，日本島津有限公司；AOC-20i 型自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津有限公司；FFAP（30 m×0.20 mm×0.25 μ m）型毛細(xì)管色譜柱，上海安因科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌液的制備

用天平稱取30 g黃酒活性干酵母加入到450 mL已滅過(guò)菌的2%葡萄糖溶液中，38 ℃保溫活化30 min，再3000 r/min離心10 min，棄去上清液，得到底部的酵母泥。取酵母泥40 g 加入到180 mL 滅菌的蒸餾水中，得到活化好的酵母菌液。

1.2.2 固定化酵母顆粒的制備

將制備的酵母菌液與9 倍1.5%的海藻酸鈉溶液混勻，在37 ℃水浴條件下用10 mL注射器滴加到4%CaCl2溶液中。在21 ℃水浴條件下固定化1 h，最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)遍放入0.05% CaCl2溶液，4 ℃平衡過(guò)夜，備用。

1.2.3 發(fā)酵液制備

糯米用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩備用。在1000 mL錐形瓶中放入250 g 糯米粉和625 mL 蒸餾水，攪拌均勻后加入1 g液化酶，70 ℃水浴鍋中液化60 min，冷卻至50 ℃后加麥曲37.5 g保溫糖化4 h，3000 r/min離心10 min，上清液于121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2.4 黃酒固定化發(fā)酵方法

取5 個(gè)1000 mL 的錐形瓶，每個(gè)瓶中分別加入800 mL 發(fā)酵液以及一定數(shù)量的固定化酵母顆粒，使發(fā)酵液酵母濃度分別為0.2×107個(gè)/mL、0.6×107個(gè)/mL、1.0×107個(gè)/mL、1.4×107個(gè)/mL、1.8×107個(gè)/mL 5 個(gè)水平，置于28 ℃培養(yǎng)箱主發(fā)酵5 d，而后在15 ℃下發(fā)酵15 d。

主發(fā)酵每天取樣，后發(fā)酵第7 d、9 d、11 d、14 d、17 d、20 d 取樣，分別進(jìn)行酒精度、總糖、總酸的檢測(cè)，其中檢測(cè)酒精度所得蒸餾液留樣以測(cè)定典型香氣物質(zhì)（正丙醇，異丁醇，異戊醇，苯甲醛，乙醛，β-苯乙醇，乳酸乙酯，乙酸乙酯）含量。

1.2.5 理化指標(biāo)的測(cè)定

總糖、總酸、酒精度測(cè)定方法參照國(guó)標(biāo)GB/T 13662—2018《黃酒》[8]。

1.2.6 酵母菌數(shù)的測(cè)定

采用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中酵母菌的數(shù)量[9]。

1.2.7 香氣物質(zhì)的測(cè)定[10]

色譜柱：DB-FFAP 30 m×0.20 mm×0.25 μm 毛細(xì)管色譜柱；柱流量：恒流1.5 mL/min(N2)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：25∶1；檢測(cè)器(FID)溫度：280 ℃；氫氣：40 mL/min；空氣：400 mL/min；補(bǔ)充氣(N2)：45 mL/min。柱箱溫度：50 ℃(2 min)→(10℃/min)→80 ℃→(20 ℃/min)→150 ℃→(50 ℃/min)→200 ℃(3 min)→(20 ℃/min)→230 ℃(3 min)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用origin 8.0 和excel 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母包埋量對(duì)黃酒理化指標(biāo)的影響

以不同包埋量的固定化黃酒酵母進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并取不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液進(jìn)行理化指標(biāo)的測(cè)定，酒精度、總糖、總酸的變化趨勢(shì)見圖1—圖5。

從圖1—圖5 可以看出，雖然酒精度、總糖、總酸由于酵母包埋量的不同在數(shù)值上有差異，但總體趨勢(shì)是相似的。

酒精度在主發(fā)酵期間快速上升，然后趨于平穩(wěn)，這是因?yàn)橹靼l(fā)酵階段酵母大量繁殖，利用可發(fā)酵性糖產(chǎn)生酒精。總糖在主發(fā)酵階段快速下降，但是由于酵母包埋量的不同，發(fā)酵第1 d的總糖出現(xiàn)了較為明顯的差異，0.2×107個(gè)/mL＞0.6×107個(gè)/mL＞1.0×107個(gè)/mL＞1.4×107個(gè)/mL＞1.8×107個(gè)/mL，表明酵母包埋量越大，酵母細(xì)胞能在發(fā)酵開始時(shí)就越快利用糖類物質(zhì)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，差距逐漸縮小。總酸是緩慢上升的變化趨勢(shì)。

表1 列出了不同酵母包埋量發(fā)酵結(jié)束后的理化指標(biāo)。從表1 看出，發(fā)酵結(jié)束后酵母包埋量為0.2×107個(gè)/mL 的總糖含量最高（13.3 g/L），酒精度最低（10.4%vol），包埋量為1.8×107個(gè)/mL的酸度最大（4.7 g/L）。酵母包埋量越大，酒精度越高。

2.2 酵母包埋量對(duì)黃酒發(fā)酵過(guò)程中香氣物質(zhì)生成量的影響

表1 不同酵母包埋量發(fā)酵結(jié)束后的理化指標(biāo)

發(fā)酵結(jié)束后各香氣物質(zhì)生成量的差異如圖6所示。從圖6 可以看出，酵母包埋量對(duì)醇類物質(zhì)的生成影響較大，酵母包埋量為0.2×107個(gè)/mL 生成的正丙醇、異丁醇、β-苯乙醇最多，酵母包埋量為1.8×107個(gè)/mL生成的異戊醇含量最高，這可能是因?yàn)榻湍赴窳啃r(shí)，酵母增殖倍數(shù)增多，醇類物質(zhì)生成增多，而酵母包埋量大時(shí)，則酵母基數(shù)大，繁殖多，生成的醇類也越多。

酵母包埋量對(duì)乙醛生成量的影響較大，0.6×107個(gè)/mL 生成量最大；酵母包埋量為1.0×107個(gè)/mL的乙酸生成量最多，其他4 個(gè)水平之間差異不明顯；酵母包埋量為1.0×107個(gè)/mL 的生成乙酸乙酯量最大；酵母包埋量為1.0×107個(gè)/mL 的生成乳酸乙酯的量最大。由此可見，酵母包埋量為1.0×107個(gè)/mL較適合酵母生成酯類物質(zhì)。

圖7 表明了不同酵母包埋量發(fā)酵過(guò)程中醇類、酯類總量的變化趨勢(shì)，圖8 表明了發(fā)酵結(jié)束后醇類與酯類含量的比值。

圖7 可以看出，酵母包埋量為0.2×107個(gè)/mL 生成的醇類總量最多（621.26 mg/L），而酯類總量酵母包埋量為1.0×107個(gè)/mL（119.59 mg/L）明顯要高于其他4 個(gè)水平，其他4 個(gè)水平之間差異不明顯（62.39～68.66 mg/L）。圖8 表明酵母包埋量為0.2×107個(gè)/mL和1.8×107個(gè)/mL時(shí)醇味更重，而酵母包埋量為1.0×107個(gè)/mL 發(fā)酵的黃酒醇酯比最小（3.77），醇香清雅，酯香味較強(qiáng)，香氣更加協(xié)調(diào)適中。

從圖9 可以看出，酵母包埋量為0.2×107個(gè)/mL的香氣K 值最大（12.87），產(chǎn)生的香氣強(qiáng)度大，其次是包埋量為1.0×107個(gè)/mL（11.64）。鑒于酵母包埋量為0.2×107個(gè)/mL 時(shí)，酒精度偏低（10.4%vol），因此綜合考慮理化指標(biāo)和香氣物質(zhì)生成量，酵母包埋量為1.0×107個(gè)/mL 是固定化條件下理想的酵母包埋量。

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酒酵母包埋量越大，酒精度越高。發(fā)酵結(jié)束后酵母包埋量為0.2×107個(gè)/mL發(fā)酵的黃酒酒精度較低（10.4%vol），包埋量為1.8×107個(gè)/mL 時(shí)黃酒酸度較大（4.7 g/L），這兩種酵母包埋量不適合黃酒發(fā)酵。

酵母包埋量為1.0×107個(gè)/mL 生成的酯類總量明顯高于其他4 個(gè)水平，其他4 個(gè)水平之間差異不明顯，并且酵母包埋量為1.0×107個(gè)/mL 發(fā)酵的黃酒醇酯比較小（3.77），同時(shí)香氣K 值較大（12.87），香氣強(qiáng)度大，在固定化條件下是理想的酵母包埋量。