HPLC法同時測定地參中3種三萜酸的含量

黃小蘭,何旭峰,周 濃,陽文武,楊 勤,王 騫,郭冬琴,*

(1.重慶三峽學院生物與食品工程學院,三峽庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室,重慶 404100;2.重慶市萬州食品藥品檢驗所,重慶 404100;3.重慶三峽醫藥高等專科學校中醫學院,重慶 404100)

地參又名蟲草參、地筍,為唇形科植物毛葉地瓜苗(LycopuslucidusTurcz. var.hirtusRegel)的干燥根莖,具有化瘀止血、益氣利水之功效,治黃疸,臨床上常用于治療急性黃疸型肝炎、濕熱型慢性肝炎[1-2],其地上部分為傳統藥食同源中藥材澤蘭,具有活血調經、祛瘀消癰、利水消腫之功效,臨床常用于月經不調、經閉、痛經、產后瘀血腹痛、瘡癰腫毒、水腫腹水[2]。地參主產于云南、重慶、山東、四川、陜西、河北及東北等地,具有較高的營養保健功能,是藥食兼用藥用植物,可作為蔬菜食用,其功能與冬蟲夏草相似,享有“蔬菜珍品”、“山中之王”等美譽,是我國名貴的中藥材之一[3-5]。地參在民間常制作成具有一定保健營養功能的休閑食品,如蜜酥地參、油炸地參、干地參、地參枸杞復合飲料、地參棗茶等[6-7]。因此,在倡導健康飲食潮流的今天,地參作為一種保健蔬菜,在日常食補或疾病康復中扮演著日益重要的角色,與人民健康密切相關。

研究表明,地參主要活性成分為萜類與甾體、酚酸類、黃酮類、揮發油等成分[8-10],具有抗氧化、降血脂、降血糖、增強免疫功能、抗腫瘤、減肥等藥理作用[11-14]。前期研究表明,澤蘭含有白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸[9,12],而這3種三萜酸具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、免疫調節、抗病毒、抗炎、保肝等藥理作用[15-18],與地參的藥理作用具有一定的關聯性,可作為地參品質評價的指標之一。因此,測定地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸具有一定的價值和意義。

目前,對于地參地上部位即澤蘭[2]中三萜酸類化合物含量測定的文獻多集中在白樺脂酸[19]、熊果酸[20]和齊墩果酸[21]等成分,鮮見同時測定地參中3種三萜酸含量的文獻報道。本研究采用高效液相色譜法(HPLC)對不同產地地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸含量進行研究,以期為地參藥材的質量標準提高和產品開發利用提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地參 自采或委托采集于云南大理州(S1)、廣西玉林市(S2)、江蘇徐州市(S3)、重慶萬州(S4)等4個地參栽培基地,重慶三峽學院生物與食品工程學院周游博士鑒定為唇形科植物毛葉地瓜苗(LycopuslucidusTurcz. var.hirtusRegel)的干燥根莖;白樺脂酸對照品(純度經HPLC峰面積歸一化法計算大于98%) 成都德思特生物技術有限公司;齊墩果酸對照品(純度經HPLC峰面積歸一化法計算大于98%) 成都德思特生物技術有限公司;熊果酸對照品(純度經HPLC峰面積歸一化法計算大于98%) 成都德思特生物技術有限公司;甲醇 色譜純,迪馬科技;三氟乙酸 分析純,成都科龍試劑化工廠;無水乙醇 色譜純,成都科龍試劑化工廠。

LC-20AT型高效液相色譜儀 日本島津公司;Milli-Q Advantage A10超純水機 美國Millipore公司;Sigma4-16S型高速離心機 德國Sigma公司;IKA MS3型渦旋混合器 德國IKA公司;Sartorius SQP型分析天平 德國Sartorius公司;KH-2000DB型超聲波清洗機(功率:2000 W,頻率:40 kHz) 昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 地參樣品中3種三萜酸的提取

1.2.1.1 提取工藝 將干燥的地參根莖粉碎稱重,置50 mL離心管中,按比例加入乙醇溶液[22],渦旋30 s,在一定時間和功率下超聲提取[21,23],離心轉移上清液,用乙醇溶液復提2次,合并提取液,以乙醇溶液定容至刻度,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜后,HPLC檢測計算白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量。

1.2.1.2 單因素實驗 精密稱取地參粉末(S1)1.0 g,置100 mL具塞錐形瓶中,固定超聲波功率為300 W,提取時間30 min,探究乙醇體積分數(50%、60%、70%、80%、90%、100%)對3種三萜酸提取率的影響;固定提取溶劑為無水乙醇,提取時間30 min,探究超聲功率(100、200、300、400 W)對3種三萜酸提取率的影響;固定提取溶劑為無水乙醇,提取功率300 W,探究提取時間(15、30、45、60 min)對3種三萜酸提取率的影響;平行測定3次,研究改變某一因素對地參三萜酸的影響。分別在最佳色譜條件下進樣,進行峰面積測定,計算地參中3種三萜酸類化合物的含量。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取減壓干燥至恒重的白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸對照品適量,加甲醇溶解并制成質量濃度分別為1.0123、0.9918、0.9918 mg/mL的對照品貯備液,備用。

1.2.3 樣品溶液的制備 取地參粉末(過30目篩)1.0 g,精密稱量,平行3次,置50 mL離心管中,加無水乙醇15 mL,渦旋30 s,超聲提取30 min(超聲功率300 W,工作頻率40 kHz),4000 r/min離心5 min,取上清液于50 mL棕色容量瓶中,殘渣再次加入15 mL無水乙醇復提2次。合并上清液,以無水乙醇定容至刻度,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜待測,即得。

1.2.4 色譜條件的優化

1.2.4.1 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器分別對3種三萜酸標準溶液在190～400 nm區間段進行掃描,確定3種三萜酸最佳的檢測波長。

1.2.4.2 色譜柱的選擇 以甲醇-0.03%三氟乙酸水溶液(pH=3.5)作為流動相,在柱溫30 ℃,流速0.8 mL/min條件下分別考察含碳量為8.0%、17.0%、27.0%的C18色譜柱對3種三萜酸分離度的影響。

1.2.4.3 流動相體系的選擇 在最佳色譜柱條件下,柱溫30 ℃,流速0.8 mL/min,以甲醇-水系統為基礎,分別用三氟乙酸調節流動相的pH為2.5、3.5、4.5、5.5,考察不同pH對3種三萜酸分離效果的影響。

1.2.4.4 柱溫的選擇 在最佳色譜柱、pH條件下,流速0.8 mL/min,考察柱溫分別在20、25、30、35 ℃時3種三萜酸分離效果。

1.2.4.5 流速的選擇 在最佳色譜柱、pH、柱溫條件下,考察流速分別為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min時3種三萜酸分離效果的影響。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 線性關系、檢出限和定量限的考察 分別精密吸取1.2.2項下各對照品貯備液0.025、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL,分別置10 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得到一系列不同質量濃度的3種三萜酸混合對照品溶液,置于4 ℃的冰箱內,臨用前以0.22 μm微孔濾膜濾過,按照最佳色譜條件依次進樣分析,記錄色譜圖,以3種三萜酸的保留時間、理論塔板數、拖尾因子和分離度考察方法的系統適用性。以各對照品的峰面積積分值(y)與其相應的質量濃度(x)進行線性回歸,繪制標準曲線。檢出限(limit of determination,LOD)為3倍信噪比,定量限(limit of quantifification,LOQ)為10倍信噪比,按照信噪比S/N=3和S/N=10確定3種三萜酸的檢出限和定量限。

1.2.5.2 精密度試驗 取同一混合對照品溶液,連續進樣6次,按最佳色譜條件測定各三萜酸的峰面積,分別計算各成分峰面積的相對標準偏差,以考察儀器的精密度。

1.2.5.3 重復性試驗 取地參粉末(S4)6份,按1.2.3項下方法制備樣品溶液,按最佳色譜條件測定各三萜酸的峰面積,分別計算各成分含量的相對標準偏差,以考察方法的重復性。

1.2.5.4 穩定性試驗 取地參供試品溶液(S4),在室溫下密閉放置,分別在0、2、4、6、8、12 h按最佳色譜條件測定各三萜酸的峰面積,分別計算各成分含量的相對標準偏差,以考察本樣品的穩定性。

1.2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的地參粉末(S4)0.50 g,共6份,分別精密加入白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸對照品溶液適量,按1.2.3項下方法制備樣品溶液,按最佳色譜條件測定各三萜酸的峰面積,分別計算白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的加樣回收率和相對標準偏差,以驗證該方法的準確性。

1.2.6 樣品的含量測定 分別取4批地參粉末(過30目篩)1.0 g,精密稱量,平行3份,按1.2.3項下方法制備樣品溶液,按最佳色譜條件測定并記錄色譜圖,應用標準曲線法分別計算3種三萜酸的含量。

2 結果與分析

2.1 地參中3種三萜酸的提取條件優化

2.1.1 乙醇體積分數對地參三萜酸提取量的影響 由圖1可看出,隨著乙醇體積分數的增加,地參中白樺脂酸、熊果酸的含量相應提高,齊墩果酸含量增加趨勢不明顯,3種總三萜酸含量呈現增加趨勢,當提取溶劑為100%乙醇即無水乙醇時,三萜酸總含量最高。因此,本實驗選擇無水乙醇作為提取溶劑為宜。

圖1 不同的乙醇體積分數對提取效率的影響Fig.1 Effect of different volume fractions ofalcohol on extraction efficiency

2.1.2 超聲功率對地參三萜酸提取量的影響 由圖2可看出,隨著超聲功率的增大,地參中白樺脂酸、熊果酸以及總三萜酸含量增加,當超聲功率超過300 W時,三萜酸總含量趨于平穩。因此,本實驗選擇300 W作為提取功率。

圖2 超聲功率對提取效率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency

2.1.3 提取時間對地參三萜酸提取量的影響 由圖3可知,隨著提取時間的延長,地參中白樺脂酸、熊果酸以及總三萜酸含量呈現出先增加后減少趨勢,當提取時間為30 min時,三萜酸總含量最高。因此,本實驗選擇提取時間為30 min。

圖3 提取時間對提取效率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 檢測波長的確定 通過對白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸標準溶液進行光譜掃描,結果如圖4所示,白樺脂酸在204 nm、齊墩果酸和熊果酸在205 nm處有最大吸收峰,考慮到流動相中甲醇的截止波長為205 nm,為了避免干擾[24],本方法確定210 nm為檢測波長。

圖4 白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的光譜掃描圖Fig.4 The diode array scanning spectrogram ofbetulinic acid,oleanolic acid and ursolic acid

2.2.2 色譜柱的選擇 由于被測物質白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的分子量相當、結構相似、極性差異小、存在同分異構體,比較適合在酸性條件下使用高惰性、全封端的C18色譜柱分析。由圖5可知,通過比較不同含碳量的C18色譜柱對分離度的影響,結果表明含碳量為27.0%的色譜柱Diamonsil C18(2)(5 μm,4.6 mm×250 mm)對3種三萜酸化合物具有良好的分離效果,特別是齊墩果酸和熊果酸分離度能達到1.60以上,且色譜柱Diamonsil C18(2)適用于更寬的pH范圍(1.5～9.0),耐酸性較強,更有利于3種三萜酸化合物的分離。因此,最終選擇本實驗室的Diamonsil C18(2)(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱,且通過實驗驗證Diamonsil C18(2)色譜柱的穩定性和重復性較好。

圖5 不同含碳量的C18色譜柱對分離效果的影響Fig.5 Effect of C18 column with differentcarbon content on separation result注:1.白樺脂酸;2.齊墩果酸;3.熊果酸;圖6、圖7同。

2.2.3 流動相體系的選擇 由于三萜酸類化合物在水中發生弱電離,呈弱酸性,以甲醇-水為流動相反相分離白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸時,弱酸環境有利于3種物質的分離分析。因此,水溶液的pH和甲醇比例是重要的影響因素[24-25]。由圖6可知,當用三氟乙酸將pH調至2.5～3.5時,目標物均能實現峰形尖銳對稱且分離效果良好,但pH=2.5時,基線更加平穩,保留時間適中。本方法同時還考察了流動相的比例,結果顯示選擇甲醇∶三氟乙酸水溶液(pH=2.5)=89∶11 (v∶v)作為流動相效果最佳。

圖6 不同pH對峰形和分離效果的影響Fig.6 Effects of different pH valueson peak shape and separation result

2.2.4 柱溫的選擇 通過比較不同柱溫對白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸分離度的影響發現:柱溫在20 ℃時,白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的分離度分別為4.67、4.21、1.88;25 ℃時為4.61、4.08、1.84;30 ℃時為4.14、4.01、1.61;35 ℃時為4.05、3.51、1.43。雖然柱溫在20～30 ℃范圍內均能實現良好分離,分離度大于1.50,但溫度過低會造成系統壓力過高,靈敏度下降。本試驗選擇25 ℃為最終柱溫。

2.2.5 流速的選擇 通過比較不同流速對齊墩果酸和熊果酸分離度的影響,結果顯示:隨著流速的降低齊墩果酸和熊果酸的分離度有所提高,但太低會導致峰形不夠尖銳,檢測靈敏度降低,且延長了分析時間,流速過高不利于齊墩果酸和熊果酸的分離。因此,本試驗選擇0.8 mL/min為最終流速。

2.3 混合對照品和樣品的HPLC色譜測定結果

由圖7可見,3種三萜酸能有效分離,峰形良好,且雜質干擾少,混合對照品中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的保留時間分別為22.636、26.098、27.529 min;理論塔板數分別為13570、14186、14457,拖尾因子分別為1.009、0.952、0.987;分離度分別為4.61、4.08、1.84。樣品中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的理論塔板數分別為10619、10838、10760,拖尾因子分別為1.000、0.996、0.958,分離度分別為3.83、3.60、1.62。結果表明,3種三萜酸異構體色譜峰拖尾因子在0.95～1.05,與相鄰色譜峰的分離度均大于1.50,各峰的理論塔板數均大于10000,系統適應性良好。

圖7 混合對照品(A)、地參樣品(B)的HPLC圖Fig.7 The HPLC chromatogram of mixed reference substance(A),and sample of Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel(B)

分別以白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸峰面積積分值(y)與其相應的質量濃度(x)進行線性回歸,得回歸方程,相關系數(r)、線性范圍、檢出限(LOD)和定量限(LOQ),由表1可知:白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸分別在各自質量濃度范圍內呈良好的線性關系,相關系數均大于0.9999;檢出限為5～7 ng,定量限為16～22 ng,表明方法線性范圍寬,儀器靈敏度高。

表1 3種三萜酸化合物的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Regression equation,correlation coefficient,linear range,limit of detection(LOD)and limit of quantification(LOQ)of three triterpenic acids by HPLC

2.5 精密度

白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的平均峰面積(n=6)分別為151035、225848、212479,RSD分別為0.15%、0.34%、0.34%,表明高效液相色譜儀精密度良好。

2.6 重復性

地參(S4)中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的平均含量(n=6)分別為1.684、0.312、0.750 mg/g,RSD分別為0.62%、1.79%、0.60%,表明此實驗方法的重復性較好。

2.7 穩定性

地參(S4)中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸平均含量(n=6)分別為1.690、0.310、0.750 mg/g,RSD分別為0.95%、2.77%、1.93%,表明供試品溶液至少在12 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率

地參中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的平均回收率在100.52%～103.77%范圍內,RSD在0.99%～2.42%范圍內,符合分析要求,結果見表2。表明上述實驗方法具有較高的回收率和準確度,能應用于地參中三萜酸化合物的檢測與分析。

表2 加樣回收率實驗結果(n=6)Table 2 Average recoveries of three triterpenic acids(n=6)

2.9 地參中三萜酸類化合物含量

按標準曲線法定量,分別計算地參藥材中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的含量,結果見表3。

表3 不同產地地參中3種三萜酸類成分測定結果Table 3 The content of three triterpenic acids in the

結果表明:4個不同產地地參均含有豐富的白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸,3種三萜酸含量由高到低排序為:白樺脂酸>熊果酸>齊墩果酸,白樺脂酸是其主要活性成分,其含量較高,占到總量的60%以上,這與澤蘭[19-21]中3種三萜酸成分的研究結果類似。

不同產地地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸含量存在一定的差異,其中重慶萬州、廣西玉林的3種三萜酸含量較高,江蘇徐州、云南大理的3種三萜酸含量較低;廣西玉林(S1)、云南大理(S2)、重慶萬州(S3)、江蘇徐州(S4)等4個產地地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸3種三萜酸內在的結構比(即成分間量的比)[26]分別為1.000∶0.083∶0.289、1.000∶0.098∶0.350、1.000∶0.183∶0.444、1.000∶0.117∶0.221,平均結構比為1.000∶0.120∶0.326。結果顯示同一品種地參藥材因產地不同其三萜酸類成分量及結構比均具有一定差異,并沒有明顯的規律,這與黃瑜等[26]對小根蒜中核苷類含量的研究結果相一致。

3 結論

地參是我國特有的有著諸多獨特性的民族民間藥材,資源豐富、市場商品價格低,極具開發價值。本研究建立了同時檢測地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸含量的HPLC法。通過單因素實驗,采用超聲波輔助無水乙醇提取地參中的三萜酸,超聲功率為300 W,提取時間為30 min,三萜酸的提取含量可達到2 mg/g以上。通過優化,得到最佳色譜條件:色譜柱為含碳量27.0%的Diamonsil C18(2)(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇-0.03%三氟乙酸水溶液(pH=2.5)(89∶11,v∶v);檢測波長為210 nm;體積流量為0.8 mL/min;進樣量20 μL;柱溫25 ℃。利用建立的方法對4組地參樣品進行HPLC分析,結果顯示:不同產地的地參均含有白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸,其中白樺脂酸含量最高占60%以上。

本研究建立的方法前處理簡單,專屬性強、定量準確、線性關系良好,精密度、穩定性、加樣回收率符合要求,可用于準確測定地參中三萜酸類成分的含量,適用于地參藥材、飲片及其休閑食品生產過程的品質控制指標,為地參藥材資源在保健食品方面的應用提供新的理論依據。