櫻花葉總黃酮的超聲波法提取工藝優化及其抗氧化能力的研究

杜麗娟,蘇秀芳,*,梁翠君

(1.廣西民族師范學院生物與食品工程學院,廣西崇左 532200;2.廣西高校桂西南特色植物資源化學重點實驗室培育基地,廣西崇左 532200)

櫻花(Cerasusserrulata(Lindl.))是薔薇科櫻屬的觀賞性植物。櫻花在我國廣西、福建和云南等地廣泛種植[1]。國內外學者對櫻花的研究主要集中在形態特征、栽培技術、病害防治、園林應用等方面[2]。櫻花葉是一種傳統中藥材,有止咳、平喘、宣肺、潤腸、解酒、抑制惡性腫瘤等功效[3],據研究發現,這和櫻花葉內的活性成分密切相關,如文飛龍等[4]研究發現櫻花葉的抗氧化能力與其富含的萜類呈正相關,李友偉等[5]確定了櫻花多糖的最佳提取工藝,李飛陽等[6]證實了櫻花葉的抗氧化能力與黃酮含量的關系。黃酮是一大類活性成分的總稱,具有強抗氧化、消炎、延緩衰老等功效。衛強等[3]發現櫻花葉總黃酮經聚酰胺-大孔樹脂純化后具有較強的抗炎活性,能夠明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹和降低冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性。吳練中等[7]發現櫻花葉有效成分總黃酮含量較高,具有持久緩慢降壓作用,且無毒害作用,可開發成具有保健功能的櫻花葉茶等。

超聲波提取法最早被用于提取曼陀羅葉中的生物堿[8],具有能大大縮短提取時間、保護提取物的結構、提高提取物的含量等特點。有學者將其應用于葉黃素[9]、果膠[10]、花青素[11]、胡蘿卜素[12]等物質的提取。但是關于采用超聲波法提取櫻花葉總黃酮類化合物的研究鮮有報道。本研究以櫻花葉為試驗材料,利用超聲波提取技術提取總黃酮,探究出櫻花葉中總黃酮的最佳提取工藝,并評價其抗氧化能力,以期為超聲波法應用于櫻花葉總黃酮提取、開發與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

櫻花葉 采自廣西民族師范學院;蘆丁(BR) 國藥集團化學試劑有限公司;DPPH(≥97%) 上海藍季科技發展有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、雙氧水、抗壞血酸、硫酸亞鐵、無水對氨基苯磺酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉、一水檸檬酸、無水磷酸氫二鈉、石油醚等 均為國產分析純。

HZ-2A恒溫水浴鍋 南京南大萬和科技有限公司;AR124CN電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司;722紫外分光光度計 上海舜宇恒科學儀器有限公司;KQ-500DE中文液晶臺式超聲波清洗器 昆山美美超聲儀器有限公司;DSY-9002高速萬能粉碎機 永康市九順瑩商貿有限公司;101電熱鼓風干燥箱 北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮提取 參照許建本等[13]的提取方法對櫻花葉總黃酮進行提取。

櫻花葉干燥→粉碎過篩→脫色干燥→櫻花葉粉→黃酮提取

櫻花葉干燥:將新采摘的櫻花葉直接用自來水沖洗干凈,接著用蒸餾水沖洗3遍后,自然晾干,然后放入60 ℃的干燥箱中烘12 h,即可得干燥的櫻花葉。

粉碎過篩:用粉碎機將櫻花葉進行粉碎,過60目篩后得櫻花葉粉。

脫色干燥:稱取50 g的粉末放入1000 mL的燒杯中,加入100 mL的石油醚,用磁力攪拌器攪拌1 h左右至櫻花葉粉脫色,抽濾去濾液得脫色櫻花葉粉,將櫻花葉粉放于室溫條件下自然晾干,再放入65 ℃的烘箱中干燥4 h,即得櫻花葉粉,放入封口袋保存備用。

黃酮提取:精準稱量1.0000 g櫻花葉粉末,放入錐形瓶中,按照一定的提取條件對黃酮進行提取,完成實驗過程后,抽濾并將濾液定容至100 mL的容量瓶中,即得提取液。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 設置料液比1∶20 (g/mL),超聲功率50 W,提取時間20 min,提取溫度40 ℃,其他參數和操作同方法1.2.1,探究不同的乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)對總黃酮得率的影響。

1.2.2.2 料液比對總黃酮得率的影響 設置乙醇濃度為50%,超聲功率50 W,提取時間20 min,提取溫度40 ℃,其他參數和操作同方法1.2.1,探究不同的料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)對總黃酮得率的影響。

1.2.2.3 超聲功率對總黃酮得率的影響 設置乙醇濃度為50%,料液比1∶30 (g/mL),提取溫度40 ℃,提取時間20 min,其他參數和操作同方法1.2.1,探究不同的超聲功率(30、40、50、60、70 W)對總黃酮得率的影響。

1.2.2.4 提取時間對總黃酮得率的影響 設置乙醇濃度為50%,料液比1∶30 (g/mL),超聲功率50 W,提取溫度40 ℃,其他參數和操作同方法1.2.1,探究不同的提取時間(20、30、40、50、60 min)對總黃酮得率的影響。

1.2.2.5 提取溫度對總黃酮得率的影響 設置乙醇濃度為50%,料液比1∶30 (g/mL),超聲功率50 W,提取時間40 min,其他參數和操作同方法1.2.1,探究不同的提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對總黃酮得率的影響。

1.2.3 正交試驗設計 根據單因素實驗結果,選取乙醇濃度(%)、料液比(g/mL)、超聲功率(W)、提取時間(min)這四因素的三個水平,在最佳溫度70 ℃下進行L9(34)正交試驗,以確定櫻花葉粉的總黃酮最佳提取工藝。

1.2.4 總黃酮得率的測定 參照Aadil等[14]的測定方法,以蘆丁為標準,制備蘆丁標準曲線,得到回歸方程為:y=10.85x-0.001,R2=0.9994。精準移取0.50 mL的櫻花樹葉總黃酮提取液,放入到25 mL的比色管中,移入0.30 mL 5%的亞硝酸鈉溶液,混勻,室溫條件下靜置6 min,移取0.30 mL10%的硝酸鋁溶液放入比色管中,混勻,室溫條件下靜置6 min,移入4.00 mL 4%的NaOH溶液,用相對應的乙醇溶液定容至25 mL刻度線。混勻,靜置15 min。采用對應的乙醇溶液為空白對照,在波長為510 nm處,測出提取液的吸光度值,總黃酮得率的計算公式見式(1):

式(1)

式中：C為黃酮的濃度(mg/mL)；V為樣品溶液的體積(mL)； X為稀釋倍數；M為櫻花葉干粉末的質量(mg)。

1.2.5 抗氧化能力的測定

1.2.5.1 ·OH清除能力的測定 參照馬玲龍等[15]的測定方法，移取1 mL櫻花葉總黃酮提取液于比色管中，依次移入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混勻，然后在37 ℃的水浴鍋中反應30 min后，在510 nm波長處測吸光值，記為A1。在同一條件下測定櫻花葉總黃酮提取液與FeSO4、水楊酸-乙醇溶液、蒸餾水混合后的吸光值A2以及蒸餾水與FeSO4、水楊酸-乙醇溶液、H2O2溶液混合后的吸光值A0。

以抗壞血酸(VC)做陽性對照，計算公式見式(2)：

·OH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(2)

1.2.5.2 DPPH·清除能力的測定 參照Huang等[16]的測定方法，配制0.001 mg/mL的DPPH溶液。在比色管中加入DPPH溶液和櫻花葉總黃酮提取液，搖勻，常溫黑暗條件下放置30 min后，在波長為517 nm處測吸光值，記為A1。在同一條件下測定DPPH與無水乙醇混合后的吸光值A0，以及提取液與無水乙醇混合后的吸光值A2。以抗壞血酸(VC)為陽性對照。計算公式見式(3)：

DPPH·清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(3)

1.2.5.3 NaNO2清除能力的測定 參照王敏等[17]的測定方法，移取2 mL櫻花葉總黃酮提取液于10 mL的比色管中，依次向比色管中加入5 mL的pH3.0檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液、1 mL 100 μg/mL的NaNO2溶液，并用蒸餾水定容至刻度線。于37 ℃的水浴中反應1 h后冷卻至室溫。從比色管中移取1 mL液體放入新的10 mL的比色管中，依次加入2 mL 4 mg/mL的對氨基苯磺酸溶液、1 mL 2 mg/mL的鹽酸萘乙二胺，并用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min后，于波長為540 nm處測定吸光度值，記為A。用蒸餾水取代總黃酮提取液，其他操作步驟同上，所測的吸光度值，記為A0。

配制相同濃度梯度的抗壞血酸(VC)溶液,采用上述方法,與待測液進行對比。計算公式見式(4):

NaNO2清除率=(A0-A)/A0×100

式(4)

1.3 數據處理

所有數據重復測定三次,取均值,采用Origin 8.5、SPSS 19.0軟件進行圖片繪制和數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對櫻花葉總黃酮得率的影響 由圖1可見,當乙醇濃度在30%～50%之間時,隨著乙醇濃度的升高,總黃酮得率隨之增加,當乙醇濃度為30%時,總黃酮得率低至7.37%,當乙醇濃度在40%～60%時,總黃酮得率變化不大,乙醇濃度為50%時總黃酮得率出現最大值,此時總黃酮得率為12.41%。在乙醇濃度大于50%時,總黃酮得率隨乙醇濃度的增大而緩慢下降,原因可能是乙醇濃度過高時,其他脂溶性物質、黏性物質大量溶出,與可溶性總黃酮形成競爭關系,影響總黃酮的析出,最終導致總黃酮得率下降,喬孟等[18]在研究過程中也出現了類似現象。因此選取乙醇濃度為50%時作為總黃酮提取的最適宜濃度。

圖1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol volumefraction on total flavonoids yield

2.1.2 料液比對櫻花葉總黃酮得率的影響 圖2表明,料液比在1∶20～1∶30 g/mL的范圍內,總黃酮得率呈上升趨勢。當料液比為1∶30時出現高峰值,得率高達14.21%,當料液比超過1∶30時,乙醇溶液相對于固體樣品的體積量越大,總黃酮得率呈下降趨勢。當料液比較低時乙醇溶液較少,不利于總黃酮的溶解,當料液比過高時,雜質溶出的幾率增加,從而導致總黃酮溶解量下降,同時造成資源的浪費[19]。由此可見,提取櫻花葉總黃酮的料液比以1∶30為宜。

圖2 料液比對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ratio of materialto liquid on total flavonoids yield

2.1.3 超聲功率對櫻花葉總黃酮得率的影響 由圖3可見,總黃酮的得率隨超聲功率的增大呈先上升再下降的趨勢。當功率在30～50 W的范圍內,總黃酮得率隨著功率的增大而上升,當功率為50 W時達到一個高峰,此時的總黃酮得率高達13.88%。功率超過50 W后,總黃酮得率隨功率的增大出現明顯的下滑,這是由于超聲波功率過大會導致總黃酮類化合物遭到破壞,故選取50 W為適宜超聲功率。

圖3 超聲功率對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield

2.1.4 提取時間對櫻花葉總黃酮得率的影響 由圖4表明,隨著提取時間的增加,總黃酮的得率呈現出先升高再降低的規律,當提取時間在20～40 min內,總黃酮得率隨時間的增加而升高,當提取時間為40 min時出現一個高峰值,此時的總黃酮得率高達13.76%,當提取時間大于40 min后,總黃酮得率隨著提取時間的增加而降低,這可能是因為時間過長會導致部分的總黃酮被氧化或分解,使總黃酮得率下降,這一點和孫晶等的研究一致[20]。因此,櫻花葉總黃酮的最佳提取時間為40 min。

圖4 提取時間對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on total flavonoids yield

2.1.5 提取溫度對櫻花葉總黃酮得率的影響 圖5結果表明,當提取溫度在40～70 ℃的范圍內,總黃酮得率隨溫度的增大而呈現緩慢上升的趨勢,當提取溫度達到70 ℃時,總黃酮得率最高,高達13.78%,當溫度高于70 ℃后,總黃酮得率會隨著溫度的升高而降低,這是因為溫度過高會導致熱穩定性較弱的總黃酮分解[21],黃酮苷發生水解,黃酮苷元聚合,羥基氧化,苯環破壞,進而影響活性發揮,從而降低總黃酮得率,該現象在杜仲葉黃酮的研究中也出現類似的結果[22]。基于此,櫻花葉總黃酮的最佳提取溫度選取70 ℃為宜。

圖5 提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperatureon total flavonoids yield

2.2 正交試驗

根據單因素實驗結果,在提取溫度為70 ℃時,選取乙醇溶液的濃度、料液比、超聲波功率、提取時間四個影響因素。按照表1設計L9(34)正交試驗,得出櫻花葉總黃酮得率,結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 櫻花葉總黃酮提取正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experimenton extraction of total flavonoids from Cerasus leaf

表2、表3的數據表明,四個因素對櫻花葉總黃酮得率的影響順序是:乙醇濃度>料液比>超聲功率>提取時間,其中乙醇濃度對櫻花葉總黃酮的得率呈顯著影響(P<0.05),料液比、超聲功率和提取時間均未達到顯著影響(P>0.05)。根據正交試驗結果,櫻花葉總黃酮最佳提取工藝為A3B3C2D3,即乙醇濃度為60%,料液比為1∶35 g/mL,超聲功率為50 W,提取時間為50 min,提取溫度70 ℃。按最佳提取工藝條件進行3次平行試驗,測得黃酮得率分別為14.79%、14.65%、14.79%,平均值為14.74%,高于表2中正交試驗中最高得率14.47,表明正交試驗優選得出的工藝條件具有可靠性。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.3 櫻花葉總黃酮提取液的抗氧化能力

2.3.1 櫻花葉總黃酮對·OH清除能力的測定 由圖6可以得出,總黃酮提取液質量濃度在0.4 mg/mL時·OH的清除率較低(為31.87%),隨著質量濃度的不斷升高,清除率呈明顯的上升趨勢[23],其對·OH的清除能力隨著質量濃度的增大而加強。在0.4～1.2 mg/mL的濃度范圍之間,總黃酮提取液對·OH的清除能力略低于抗壞血酸(VC)。當櫻花葉總黃酮濃度為1.2 mg/mL時,對·OH的清除率達到79.12%,經過兩者的對比,表明櫻花葉總黃酮具有較良好的抗氧化活性。

圖6 櫻花葉總黃酮對·OH的清除能力Fig.6 The ·OH scavenging ability oftotal flavonoids in the Cerasus leaf

2.3.2 櫻花葉總黃酮對DPPH·清除能力的測定 由圖7可以得出,櫻花葉總黃酮以及抗壞血酸(VC)的濃度不斷增大,對DPPH·的清除能力也不斷提高,王芳等[24]提取菠蘿皮總黃酮也出現同樣規律。當櫻花葉總黃酮濃度為0.50 mg/mL時,對DPPH的清除率達到94.60%,接近抗壞血酸對DPPH·清除的能力(97.50%)。

圖7 櫻花葉總黃酮對DPPH·清除能力Fig.7 The DPPH· scavenging ability oftotal flavonoids in the Cerasus leaf

2.3.3 櫻花葉總黃酮對NaNO2清除能力的測定 由圖8可知,質量濃度范圍在0.20～1.40 mg/mL之間時,櫻花葉總黃酮提取液對亞硝酸鈉的清除率隨著濃度的增大而呈明顯的上升趨勢,當櫻花葉樣品濃度為1.40 mg/mL時,對亞硝酸鈉的清除率達到66.55%,說明櫻花葉總黃酮具有一定的抗氧化能力。

圖8 櫻花葉總黃酮對亞硝酸鈉清除能力Fig.8 NaNO2 scavenging ability oftotal flavonoids in Cerasus leaf

3 結論

以櫻花葉為研究對象,采用超聲波法提取櫻花葉總黃酮,并對其抗氧化能力進行探究,通過實驗發現總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度60%、料液比1∶35 g/mL、超聲功率50 W、提取時間50 min、提取溫度70 ℃,此條件下,櫻花葉總黃酮的得率高達14.74%。櫻花葉總黃酮提取液的質量濃度越大,對·OH、DPPH·以及亞硝酸鈉的清除能力就越強。當櫻花葉總黃酮的質量濃度為1.2 mg/mL時,對·OH的清除能力為79.12%,當櫻花葉總黃酮的質量濃度為0.5 mg/mL時,對DPPH·的清除能力為94.60%,當櫻花葉總黃酮的質量濃度為1.4 mg/mL時,對NaNO2的清除能力為66.55%,表明櫻花葉具有較強的抗氧化能力,可開發成具有抗氧化作用的保健食品。