駱駝瘤胃乳酸菌的分離、鑒定及其降解吲哚的功能研究

朱雅琴,黃煦杰,江 巖,李佳雯,劉蔓萩,曾獻春,*

(1.新疆大學生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046;2.成都醫學院檢驗醫學院,四川成都 610500)

吲哚是吡咯與苯并聯的化合物,稱苯并吡咯,屬于含氮雜環化合物。吲哚分子式為C8H7N,難溶于水,易溶于50%～100%乙醇、異丙醇及二氯甲烷等有機溶劑。吲哚及其衍生物在自然界分布廣泛,存在于天然有機物、溫血動物腸道、糞便和煤焦油中[1-2]。吲哚作為腸道毒素,當腸道菌群微生態環境被內外因素破壞,腐敗菌和致病菌大量繁殖且分解食物、膽汁可以產生吲哚[3],其在體內長期蓄積將導致機體發生病理變化,如引發炎癥、損傷結腸、損害中樞神經系統和肝臟[4]。吲哚也可以協同致癌,通過亞硝酸鹽促進次生胺的亞硝化作用,起到癌癥促進劑的作用,具有致畸、致突變性,對環境和機體造成危害,已日益引起人們的關注[5]。目前獲得的降解吲哚的微生物,主要來自被污染的環境,其中以不動桿菌、假單胞菌、銅綠假單胞菌、產堿桿菌、伯克霍氏菌和羅爾斯通菌屬微生物最多[6]。羅海恩從焦化廠兼氧池水樣分離得到芽孢桿菌L1對吲哚和喹啉的降解率高達74.4%[7],楊冰玉等從近海泥沙樣品分離得到的產堿桿菌YBY,其可在14 h內降解100 mg/L吲哚[8]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是人及動物腸道中極為重要的菌群之一,對人、畜機體均有益。腸道中的乳酸菌依靠腸道黏附進行營養代謝,發揮重要的生物學功能[9],大量研究證實乳酸菌作為益生菌具有降解有害物質如吲哚[10]、3-甲基吲哚[11]、亞硝酸鹽[12-14]、苯并芘[15-16]、雜環胺[17]和多種霉菌毒素[18-19]等功能,其具有降解和轉化腸道內有害物質[20]、清除致病毒素、維持腸道平衡的作用。乳酸菌降解有害物質的機制主要是其可產生分解有機物、脂肪酸、亞硝胺、內毒素的特殊酶系[21]。高鵬飛等[22]研究發現，以益生乳酸菌植物乳桿菌P-8飼喂肉雞,試驗組肉雞糞便中吲哚含量顯著低于對照組(P<0.05)。并且有報道研究表明肉雞盲腸或直腸微生物組成的體外發酵液,隨著乳酸桿菌和雙歧桿菌數量的增加導致吲哚和糞臭素的水平降低[23]。

駱駝(Camelusbactrianus)是新疆特色養殖家畜,能夠在極端干旱、鹽堿的環境中生長[24]。作為典型的荒漠動物,駱駝攝入狼毒、駱駝蓬、假木賊等有毒的野生植物卻不會中毒,其原因主要依賴駱駝消化道中的微生物能夠降解、清除這些植物毒素,前期研究發現植物毒素結構與雜環化合物基本結構相似[25],推測駱駝消化道微生物可以降解含氮雜環化合物。目前,對駱駝瘤胃微生物的研究主要集中在菌落多樣性及木質纖維素降解能力方面,而對吲哚降解研究甚少。有研究發現駱駝瘤胃和腸道微生物能夠降解雜環化合物[26],從駱駝瘤胃內容物分離得到的乳桿菌屬對駱駝蓬有降解作用[27],對雜環化合物吡啶的降解率在108 h內達到100%[28]。Mohammed等[29]也報道了山羊瘤胃微生物對吲哚及其化合物有一定的降解能力。

因此本研究從駱駝瘤胃中分離、純化菌株，獲得乳酸菌,并在體外開展乳酸菌降解吲哚的研究,通過GC-MS定時定量測定乳酸菌對吲哚的降解量,了解其降解能力,獲得高效降解吲哚的乳酸菌,為進一步拓展乳酸菌的益生功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙峰駱駝瘤胃內容物 烏魯木齊市屠宰場提供;吲哚標準品 色譜純,Aladdin試劑有限公司;二氯甲烷 分析純,天津市致遠化學試劑有限公司。

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS) Agilent;U-3010紫外-可見分光光度計 Hitachi公司;PCR反應擴增儀 加拿大BBI公司;凝膠成像系統 Gene Genius公司。

1.2 培養基的配制

MRS固體培養基:葡萄糖20.0 g,牛肉浸膏15.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母浸膏5.0 g,無水乙酸鈉5.0 g,磷酸二氫鉀2.62 g,檸檬酸氫二銨2.0 g,七水硫酸鎂0.58 g,四水硫酸錳 0.198 g,瓊脂粉 20 g,吐溫-80 1.0 mL,無菌水1000 mL,pH6.0～6.5,121 ℃滅菌20 min。

無機鹽培養基:磷酸氫二鈉4.26 g,磷酸二氫鉀2.65 g,硝酸銨1 g,七水硫酸鎂0.2 g,氯化鈣0.02 g,七水硫酸亞鐵0.01 g,七水硫酸錳0.002 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養基:蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,酵母浸出粉5 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min。

1.3 駱駝瘤胃內容物中乳酸菌的篩選

1.3.1 乳酸菌的初篩 無菌采集烏魯木齊市屠宰場3頭駱駝瘤胃內容物,用無菌生理鹽水倍比稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8,分別吸取每個稀釋度溶液100 μL,涂布接種于MRS固體培養基,于37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。挑取表面光滑、凸圓、邊緣完整、顏色呈乳白色的單菌落,反復進行分離純化2～3次后,挑取疑似乳酸菌生長特征的菌落進行后續試驗。

1.3.2 乳酸菌的復篩 將初篩得到的菌株進行革蘭氏染色、接觸酶實驗,對革蘭氏陽性、接觸酶陰性菌株進行分子生物學鑒定。

1.4 乳酸菌的鑒定

1.4.1 提取菌株總DNA、PCR擴增及菌種鑒定 使用OMEGA土壤DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA,根據細菌通用引物16S rDNA 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)設計通用引物[30]。反應體系總體積為50 μL,10×Taq Buffer(含Mg2+)5 μL,DNA模板2 μL,d NTPs 5 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,Ex-Taq酶0.75 μL,ddH2O 35.25 μL。反應程序:94 ℃ 5 min預變性;94 ℃ 45 s;55 ℃ 45 s;72 ℃ 75 s;35個循環,72 ℃延伸10 min。

1.4.2 建立系統發育樹 得到的PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,再使用SuPrep凝膠DNA提取試劑盒進行純化后測序。將各菌的16S rDNA測序結果申請登錄號后,與GenBank上所提交的細菌序列進行比對,通過Blast功能篩選出同源性較高的菌,用Neighbor-Joining法構建系統發育樹[27]。

1.5 駱駝瘤胃乳酸菌對吲哚降解能力的測定

1.5.1 駱駝瘤胃乳酸菌降解吲哚實驗 將篩選得到的4株乳酸菌接種至MRS培養基上進行活化。將活化后的乳酸菌接種到LB培養基中,37 ℃,180 r/min振蕩培養24 h。將培養的菌液于4000 r/min離心5 min,收集沉淀,用無機鹽培養基洗滌3次,收集沉淀,加入無機鹽培養基制成吸光度值(600 nm)為2的菌懸液。以接種量5%將菌懸液接種到以吲哚為唯一碳源、氮源的無機鹽培養基中,37 ℃,180 r/min振蕩培養,每株菌有三個平行實驗。每隔12 h取樣測定乳酸菌的吸光度值(600 nm)和吲哚殘留量,繪制乳酸菌生長曲線和降解曲線。

1.5.2 吲哚的萃取 每隔12 h從無機鹽培養基中吸取菌液 5 mL,加入二氯甲烷5 mL,用超聲波混勻后,靜置過夜,收集下層二氯甲烷萃取液[31]。

1.5.3 吲哚含量的測定

1.5.3.1 GC-MS條件 GC條件:色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm);載氣:氦氣(99.999%);流速:1.0 mL/min;進樣量:1 μL;進樣方式:分流進樣;分流比:50∶1;進樣口溫度:250 ℃;程序升溫:初始溫度40 ℃,保持0.5 min,再以20 ℃/min的速度升溫到110 ℃。后運行240 ℃,保持1 min。MS條件:離子源溫度:230 ℃;接口溫度:280 ℃;四極桿:150 ℃;電子轟擊能量:70 eV;溶劑延遲時間:2.1 min;掃描方式:全掃描模式,因排除有雜峰干擾的可能性,定性掃描范圍為20～550 m/z。質譜庫:NIST2011。

1.5.3.2 定性方法 根據吲哚標準品在色譜圖中的出峰時間進行定性。

1.5.3.3 定量方法 吲哚標準曲線的制定:配制吲哚濃度為400 mg/L的標準儲備液,加入適量的二氯甲烷,配制25、50、100、300、400 mg/L五個濃度,分別進樣后,以濃度為橫坐標,定性離子(m/z,117.1)的峰面積為縱坐標,求出標準曲線方程,以此計算被測樣品中吲哚的殘留量。

1.5.4 吲哚降解率的計算 收集1 μL二氯甲烷萃取液注入GC-MS聯用儀,測定無機鹽培養基中吲哚殘留量,了解菌株對吲哚的降解能力。降解率計算見公式(1)。

式(1)

式中:R1,吲哚降解率,%;A,吲哚初始量,mg/L;B,吲哚殘留量,mg/L。

1.6 數據處理

應用Microsoft Excel 2013軟件對實驗數據進行簡單處理后,利用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌初步篩選

挑取MRS固體培養基中表面光滑、凸圓、邊緣完整、顏色呈乳白色的單個菌落進行革蘭氏染色,于油鏡下觀察,結果如圖1。四株菌染色后均呈紫色,為革蘭氏陽性菌,菌體為短桿狀,兩端鈍圓,無芽孢,無鞭毛。過氧化氫酶試驗陰性,初步確定為乳酸菌。

圖1 顯微形態圖Fig.1 The morphology by microscope注:A～D分別為GU366027、GU366034、GU366021、GU366019的顯微形態圖(1000×)。

2.2 乳酸菌的鑒定

對菌的16S rDNA序列進行擴增,得到的片段長度約1500個堿基對,電泳檢測擴增片段,結果見圖2。將獲得的4株乳酸菌的16S rDNA序列向GenBank申請,并獲得登錄號,登錄號為GU366019、GU366021、GU366027、GU366034。將16S rDNA測序結果與GenBank 中BLAST比對,構建系統發育樹,見圖3。由系統發育樹可知,GU366019、GU366027、GU366021、GU366034均歸屬為乳桿菌屬,其中GU366019、GU366027、GU366021為德氏乳桿菌亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.),GU366034為馴馬乳桿菌(Lactobacillusequicursoris)。

圖2 菌株GU366019、GU366021、GU366027、GU366034的PCR產物電泳圖Fig.2 PCR amplification of stains GU366019,GU366021,GU366027 and GU366034

圖3 菌株GU366019、GU366021、GU366027、GU366034的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains GU366019,GU366021,GU366027 and GU366034

2.3 吲哚的定性

根據GC-MS結果可知標準樣品吲哚的保留時間即出峰時間為:3.732 min,見圖4。在定性質量范圍為(m/z)20～550,參照NIST2011標準譜圖庫確定吲哚的定性離子質荷比(m/z)為117.1、90.1、63.1,見圖5。由圖6可知,菌株GU366027、GU366034、GU366021、GU366019在降解吲哚實驗中,培養96 h時色譜圖中出峰時間分別為3.733、3.738、3.739、3.735 min,與標準物質相近,因此可判定出峰時間3.732 min左右的峰面積為無機鹽培養基中吲哚殘留量。

圖5 吲哚標準品質譜圖Fig.5 Mass spectra of indole standard sample

圖6 四株菌降解吲哚實驗96 h時的色譜圖Fig.6 Chromatogram of indole degradation of four strains at 96 h 注:A～D分別為菌株GU366027、GU366034、GU366021、GU366019降解吲哚時的色譜圖。

圖4 吲哚標準品色譜圖Fig.4 Chromatograms of indole standard sample

2.4 吲哚標準曲線的制作及回收率測定

制定吲哚標準曲線,以峰面積為縱坐標,其濃度為橫坐標,求出標準曲線方程,曲線方程:y=6473.1x+22254(y是面積,x是濃度),R2=0.9997,見圖7。并采用標樣加入法測定回收率,將吲哚標準品測定量與吲哚標準品加入量的比值作為回收率結果,平均加樣回收率為91.33%～108.48%。

圖7 吲哚的標準曲線Fig.7 Standard curve of indole

2.5 駱駝瘤胃乳酸菌對吲哚的降解能力研究

通過紫外分光光度計測定OD600,得到菌株生長曲線;使用GC-MS測定吲哚的殘留量,并通過標準曲線計算吲哚的降解率,結果見圖8。四株乳酸菌接種到以吲哚(500 mg/L)為唯一氮源、碳源的無機鹽培養基后,由于營養物質的缺乏,菌體總體生長緩慢,當菌體逐漸適應培養環境后,GU366027、GU366034、GU366019、GU366021都可以將培養基中的吲哚作為碳源、氮源加以利用,促進菌體生長繁殖,在培養過程中,菌株對吲哚的降解情況詳見表1。由表1和圖8可知,培養初期(24 h)四株菌就開始利用吲哚,GU366027、GU366019、GU366021對吲哚的降解率達到30%左右,GU366034為17%。隨著培養時間的延長,菌株的數量不斷增加的同時,吲哚的降解率也不斷增加,在培養中期(72 h),GU366019、GU366021降解率超過50%,這兩株菌在培養120 h時的降解率超過80%。培養后期(144 h),GU366019、GU366021、GU366027已經將培養基中的吲哚完全降解。總體來說GU366034在整個培養過程中對吲哚的降解速率相對較慢,在120 h時降解率是53%,到156 h時降解率達到100%,其在培養后期降解效率高。GU366019、GU366021、GU366027三株菌對培養基中的吲哚降解速率高,培養前期降解能力強。實驗結果顯示了四株來源于駱駝瘤胃的乳酸菌對高濃度的吲哚有較強的耐受及降解能力。

表1 GU366027、GU366034、GU366019、GU366021對吲哚的降解率Table 1 Degradation rate of indole by GU366027,GU366034,GU366019 and GU366021

圖8 乳酸菌生長曲線及降解吲哚曲線Fig.8 The growth curve and indole degradation curve of lactic acid bacteria注:A～D分別為GU366027、GU366034、GU366021、GU366019的生長曲線和吲哚降解曲線。

目前已經獲得了許多具有吲哚降解能力的細菌,主要來源于被污染的環境,例如石油污染的土壤、焦化廠的兼氧池水樣、污水處理廠的污泥等[7,32-33],而來源于動物消化道的乳酸菌降解吲哚的相關研究較少。本實驗篩選得到的四株乳酸菌來源于駱駝瘤胃,體外可耐受并降解利用高濃度的吲哚。作為乳酸菌與來源于污染環境中的微生物相比,在污染物處理和腸道毒素降解過程中具有一定的安全性。后期實驗將對降解菌開展育種和培養條件的優化研究,縮短降解時間,提高降解效率,希望能用于腸道毒素和環境污染物的降解。

3 結論

本研究從駱駝瘤胃中分離篩選得到四株乳酸菌:GU366019、GU366027、GU366021、GU366034均歸屬為乳桿菌屬,其中GU366019、GU366027、GU366021為德氏乳桿菌亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.),GU366034為馴馬乳桿菌(Lactobacillusequicursoris)。通過體外吲哚降解能力測定,四株乳酸菌對高濃度(500 mg/L)的吲哚降解率達到100%。本研究拓展了動物消化道微生物的應用范圍,擴充了降解吲哚的微生物資源,乳酸菌的相對安全性將避免應用過程中對環境和機體產生危害。本研究為后期開展乳酸菌降解吲哚的機制及治理環境污染物的相關研究奠定基礎,為乳酸菌降解腸道毒素研究提供實驗方法和理論依據。