槲皮素對腦出血大鼠神經細胞凋亡與Bcl-2、Bax蛋白表達的作用研究

涂鄂文　陳瓊　寧敏　王照

〔摘要〕 目的 通過觀察大鼠腦出血后神經細胞凋亡與Bcl-2、Bax蛋白表達的動態變化及槲皮素的干預作用，探討槲皮素可能的神經保護作用及機制。方法 以雄性健康SD大鼠通過自體血注入法制備大鼠腦出血模型，并隨機分為假手術組、腦出血模型組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組，共4組，每組30只;槲皮素低劑量組和槲皮素高劑量組分別給予槲皮素10、50 mg/（kg·d）腹腔內注射，假手術組和腦出血模型組給予同等體積生理鹽水腹腔內注射，每日1次，連續7 d;各組大鼠分別在術后第6小時、1天、2天、3天、7天通過前肢放置試驗評分法評估神經功能缺損，采用TUNEL法檢測血腫周圍神經細胞凋亡，采用Western blot法檢測血腫周圍Bcl-2和Bax蛋白的表達情況。結果 與模型組比較，槲皮素低劑量組在腦出血后第3天、7天及槲皮素高劑量組在第2天、3天、7天的前肢放置試驗評分和Bcl-2蛋白表達均明顯增加（P<0.01）;與模型組比較，槲皮素低劑量組在第3天、7天及槲皮素高劑量組在第1天、2天、3天、7天的神經細胞凋亡率和Bax蛋白表達均明顯降低（P<0.01）。結論 槲皮素能減輕腦出血后神經功能損傷，其機制可能與上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，從而減少神經細胞凋亡有關。

〔關鍵詞〕 腦出血;槲皮素;細胞凋亡;Bcl-2蛋白;Bax蛋白

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.05.009

〔Abstract〕 Objective To investigate the possible neuroprotective mechanism of quercetin by observing the intervention effect of quercetin and the dynamic change of expressions of Bcl-2 and Bax and neural cell apoptosis in rats with intracerebral hemorrhage. Methods The models of intracerebral hemorrhage were prepared by autologous blood injection in male healthy SD rats and randomly divided into 4 groups， including a sham operation group， an intracerebral hemorrhage model group， a quercetin low-dose group， and a quercetin high-dose group， with 30 rats in each group. The quercetin low-dose group and the quercetin high-dose group were given quercetin 10 mg/（kg·d） and 50 mg/（kg·d） intraperitoneal injection， respectively. The sham operation group and the intracerebral hemorrhage model group were given the same volume of normal saline once a day for 7 consecutive days. Forelimb placing test score was designed to assess the nerve functional at 6 h， 1 d， 2 d， 3 d and 7 d respectively. The apoptosis index of peripheral tissues was analyzed by TUNEL staining， and the expressions of Bcl-2 and Bax were detected by the method of Western blot. Results Compared with the model group， the quercetin low-dose group and the quercetin high-dose group， respectively in 3 d， 7 d and 2 d， 3 d， 7 d after intracerebral hemorrhage had significantly increased the forelimbs placement test scores and the Bcl-2 protein expressions （P<0.01）; compared with the model group， the quercetin low-dose group and the quercetin high-dose group respectively in 3 d， 7 d and 1 d， 2 d， 3 d， 7 d， had significantly decreased apoptosis rate of nerve cells and the Bax proteins expressions （P<0.01）. Conclusion Quercetin can relieve the neurologic impairment after cerebral hemorrhage， and its mechanism may be related to the up-regulation of Bcl-2 protein expressions and down-regulation of Bax protein expressions， thus reducing the apoptosis of nerve cells.

〔Keywords〕 intracerebral hemorrhage; quercetin; apoptosis; Bcl-2 protein; Bax protein

腦出血（intracerebral hemorrhage， ICH）指腦實質內自發性、非創傷性血管破裂，導致血液在腦實質內聚集，是常見的難治性腦血管疾病之一。目前針對ICH的治療方法有限，且大多患者在接受治療后仍然遺留有不同程度的神經功能損傷。神經細胞的凋亡、血管源性腦水腫以及血腦屏障破壞是ICH后3種明顯的病理變化，其中神經細胞凋亡被認為是主要繼發性腦損傷的病理變化之一，能夠促進神經功能損傷進行性發展[1]。通過降低神經細胞凋亡從而減輕ICH后繼發性神經功能損傷的治療策略受到了越來越多研究者的關注。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，在自然界各種植物的花、葉之中有著極為廣泛分布。有研究表明槲皮素能通過抗炎[2]、抗氧化[3]、抗血栓[4]等作用減輕腦卒中后繼發性腦損傷。本研究通過觀察大鼠ICH后不同時間點神經細胞凋亡與Bcl-2、Bax蛋白表達情況以及給予不同劑量槲皮素干預后的變化，探討槲皮素可能的神經保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

采用8～12周齡、體質量250～300 g健康雄性成年清潔級SD大鼠（由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002）建立腦出血模型，實驗動物給予標準顆粒飼料和自來水分籠飼養，晝夜自然節律，將環境溫度控制在（25±2）℃、相對濕度控制在60%±10%。

1.2? 主要藥物與試劑

Bcl-2多克隆抗體（貨號：A00040-2）、Bax多克隆抗體（貨號：A00183）、TUNEL試劑盒（貨號：MK1022）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：AR0146）、β-actin內參抗體（貨號：BA2305），以上均由武漢博士德生物工程有限公司提供;槲皮素（批號：wkq16063005，質量分數≥98%），由四川省維克奇生物科技有限公司提供。

1.3? 主要儀器

Stoelting TL-2鼠腦定位儀、石蠟切片機（美國AO公司）;顯微外科手術器材、牙科鉆（上海手術器械廠）;TG 16-WS型臺式高速離心機（長沙湘儀儀器有限公司）;水平電泳槽、DYY-5型穩壓溫流電泳儀、恒溫水浴搖床、多用脫色搖床（北京六一儀器廠提供）;光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;圖像采集系統（德國Leica顯微成像系統）;Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統（美國MediaCybernetics公司）。

1.4? 造模與分組

參照RosenBerg等[5]的腦出血大鼠造模方法制備模型，大鼠經10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于Stoelting TL-2鼠腦定位儀上，使其前、后囟位于同一水平線上，沿頭皮正中線上切一長約10 mm的縱切口，充分暴露前囟，然后定位于前囟前0.2 mm，正中線向右旁開3 mm處鉆一小孔，直徑為0.5 mm，進針約5.5 mm。斬斷鼠尾取血100 μL，用微量進樣器以10 μL/min的速度緩慢注入，注血結束后留針15～20 min，緩慢退針，用骨蠟封閉顱骨，縫合皮膚。假手術組（30只）于相同部位注入等量無菌0.9%氯化鈉注射液。所有操作均在無菌條件下完成，術畢用60 w的白熾燈在距離大鼠50 cm高度持續照射直到大鼠清醒。大鼠清醒后進行前肢放置試驗評分，評分低于80及出現對側上肢向胸前屈曲和行走時對側傾倒或向對側轉圈行為，說明造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為腦出血模型組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組，每組30只。根據實驗取材的不同時間點，將上述4組組內大鼠各又隨機分成 6 h、1 d、2 d、3 d、7 d 5個亞組，每個亞組6只。

于造模成功1 h后槲皮素低、高劑量組分別給予槲皮素10 mg/kg、50 mg/kg腹腔內注射，假手術組及腦出血組則用等量生理鹽水代替處理，每天1次。

1.5? 指標檢測

1.5.1? 神經功能缺損評估? 參照Schallert等[6]的前肢放置試驗評分法評估神經功能缺損：在實驗臺前抓住大鼠軀體，讓其前肢自由懸掛在實驗臺上，用小刷子刺激大鼠手術側的觸須，未受損者可將對側前肢迅速放到桌面，腦損傷時此動作有不同程度的損害。每只大鼠受測10次，對側前肢正確放置于桌面次數的百分率即為該大鼠的評分。

1.5.2? 神經細胞凋亡檢測? 前肢放置試驗評分完成后，采用10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔內注射對大鼠進行麻醉，仰臥位固定，用生理鹽水和多聚甲醛進行心臟灌流，斷頭取腦。以血腫穿刺針點為中心分別向前、后各移1.0 mm將腦組織冠狀切開，取腦組織2塊，1塊放入-80 ℃冰箱保存備用，作Western blot檢測，另1塊常規石蠟包埋，切片，作TUNEL檢測。

采用TUNEL法檢測神經細胞凋亡：取上述腦組織切片，經脫蠟、脫水后，采用 TUNEL 法檢測細胞凋亡，具體操作按試劑盒說明書進行。經過高倍鏡（×400計數）顯微鏡觀察。每只大鼠同一部位的腦組織切片取3張，然后每張腦組織切片再取2個不重疊的視野查看陽性細胞數，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。凋亡細胞率=（凋亡細胞數/計數細胞總數）×100%。

1.5.3? 采用Western blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達? 將-80 ℃保存的腦組織置于預冷的PBS中漂洗除盡組織表面血跡，稱質量后放入機械勻漿器中，加入5倍體積量的裂解液，裂解完全，4 ℃離心收集上清液，采用BCA蛋白定量法測定裂解蛋白濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳，將電泳后的蛋白轉移至經甲醇活化的PVDF膜上，加入封閉緩沖液室溫振蕩1 h，依次孵育一抗、二抗，化學發光法曝光顯色。膠片用掃描儀將圖像輸入電腦，ImagePro-plus 6.0圖像分析軟件，β-actin蛋白作為內參照，計算Bcl-2蛋白和Bax蛋白吸光度值/內參照蛋白吸光度值的比值。

1.6? 統計學方法

實驗數據用SPSS 22.0統計軟件分析，數據均以“x±s”表示，多組計量資料均數方差齊時應用ONE-WAY-ANOVA中LSD檢驗進行方差分析，方差不齊時應用非參數秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 槲皮素對腦出血大鼠神經功能損傷的影響

腦出血模型組在手術后6 h即出現嚴重的神經功能損傷，第3天評分最低，第3天至第7天損傷減輕，其在各時間點的評分均明顯低于假手術組（P<0.01）;槲皮素低、高劑量組的評分分別在術后第3天、7天和第2天、3天、7天均明顯高于腦出血模型組（P<0.01）。結果見表1。

2.2? 槲皮素對腦出血大鼠神經細胞凋亡的影響

腦出血模型組在手術后第6小時檢測到大量凋亡神經細胞，第3天凋亡率達到高峰，第3天和第7天下降，各檢測時間點的凋亡率均明顯高于假手術組（P<0.01）;槲皮素低、高劑量組的凋亡率分別在第2天、3天、7天和第1天、2天、3天、7天均明顯低于腦出血模型組（P<0.05或P<0.01）。結果見表2和圖1。

2.3? Western blot法檢測槲皮素對腦出血大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

腦出血模型組手術后第6小時至第2天Bcl-2蛋白的表達持續減少，第2天達到低峰，第2天至第7天表達增加，第1天、2天、3天、7天較假手術組表達明顯偏低（P<0.01）;在手術后第1天、2天、3天、7天4個時間點槲皮素低、高劑量組的表達均明顯高于腦出血模型組（P<0.05或P<0.01）。結果見表3和圖2（A）。

腦出血模型組在手術后第6小時即檢測到大量Bax蛋白表達，第3天達到高峰，第3天至第7天表達減少，各檢測時間點的表達均明顯高于假手術組（P<0.01）;槲皮素低、高劑量組的表達分別在第3天、7天和第1天、2天、3天、7天明顯低于腦出血模型組（P<0.01）。結果見表4和圖2（B）。

3 討論

細胞凋亡亦稱程序性細胞死亡，與細胞的正常發育有關，使得損壞細胞或者機能紊亂細胞的自我毀損能夠在一種可控的方式下進行，是機體在生長、發育和受到外來刺激時，清除衰老和受損傷細胞以保持機體內環境平衡的一種自我調節機制[7]。近10余來年，有一系列針對ICH動物模型及人腦組織標本的研究均證實了ICH后血腫周圍組織中存在大量凋亡的神經細胞[8-9]。神經細胞凋亡是血腫周圍神經細胞死亡的主要方式，也是繼發性神經功能損害的主要表現形式，能誘發神經功能損傷的進行性發展。揭示腦出血后神經細胞凋亡的時相變化規律，是實施藥物治療的基礎和依據。本研究發現，大鼠腦出血后第6小時即檢測出較多凋亡的神經細胞，并于第1天、2天呈進行性加重，第3天細胞凋亡率達高峰，第3天至第7天緩慢降低，研究結果與CHEN等[10]研究的結果較一致。在測定ICH大鼠前肢放置試驗評分和血腫周圍神經細胞凋亡率的基礎上采用雙變量Pearson相關系數分析法對二者進行相關性分析發現，二者呈負相關關系（r=0.939，P<0.05），即ICH后神經功能缺損程度與神經細胞的凋亡率呈正相關關系。研究結果進一步證實，神經細胞凋亡參與了ICH后繼發性腦損傷過程，降低神經細胞凋亡可作為ICH臨床治療的一種治療策略。從降低ICH后神經細胞凋亡的治療角度，結合ICH后神經細胞凋亡的變化規律分析，ICH后越早進行藥物干預所取得治療效果越理想。

ICH后繼發性腦損傷導致神經細胞凋亡的機制非常復雜，其中，分別由線粒體和死亡受體介導的“內源性”及“外源性”凋亡途徑，是目前被普遍接受的細胞凋亡的兩條途徑[11]。線粒體介導的內源性凋亡途徑是哺乳動物細胞凋亡的主要途徑，也是目前研究凋亡的熱點;在該途徑中，Bcl-2家族蛋白中促凋亡和抗凋亡蛋白相互作用，調控著線粒體結構及功能的穩定性，在細胞凋亡的進程中起著至關重要的作用[12]。當細胞受到損傷因素刺激后，Bax蛋白轉移至線粒體的外膜上，通過形成Bax/Bax同源二聚體在線粒體平面脂雙層中能形成孔道及參與線粒體通透性轉變孔道（permeability transition pore， PTP）的開放，引起Cyt C、凋亡誘導因子和核酸內切酶G等被釋放到細胞質中，誘發細胞凋亡[13-14]。Bcl-2蛋白可與Bax蛋白結合形成穩定的Bcl-2/Bax異源二聚體，從而維持Bax等促凋亡蛋白在細胞內的定位與分布，維持線粒體膜穩定，防止促凋亡相關蛋白、Cyt C等泄漏至細胞質，阻斷細胞發生凋亡[15]。Bax蛋白、Bcl-2蛋白對細胞凋亡的調控不僅與其自身表達量有關，也與兩者之間的比值變化密切相關，Bcl-2/Bax蛋白比值增加，細胞趨向于存活;Bcl-2/Bax蛋白比值降低，細胞趨向于凋亡。本研究發現，大鼠腦出血后第6小時至第2天Bcl-2蛋白的表達持續減少，第2天達到低峰;同時在出血后第6小時即檢測到大量Bax蛋白表達，第3天達到高峰;第6小時至第2天血腫周圍Bcl-2/Bax蛋白的比值降低，第3小時至第7天比值升高，結果與Lu等[16]和Chen等[17]研究結果較一致。進一步的采用雙變量Pearson相關系數分析法對神經細胞凋亡率與Bcl-2/Bax蛋白比值之間進行相關性分析發現，二者呈負相關關系（r=0.880，P<0.05）。研究提示，Bcl-2、Bax蛋白表達改變可能是腦出血后導致神經細胞凋亡的機制之一;干預Bcl-2、Bax蛋白表達，有望降低腦出血后神經細胞凋亡，減輕繼發性神經功能損傷。

研究表明，槲皮素可通過降低脂質過氧化產物丙二醛含量和提高超氧化物歧化酶活性，減少氧化誘導的細胞凋亡[18];可通過增加抗凋亡Bcl-2蛋白表達、降低促凋亡Bax蛋白表達及Caspase-3活性，減少經線粒體途徑介導的細胞凋亡[19]。本研究以槲皮素干預后對ICH大鼠血腫周圍神經細胞凋亡與Bcl-2、Bax蛋白表達的影響為切入點展開研究。結果顯示，與腦出血模型組相比，不同劑量槲皮素干預后Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達下降，Bcl-2/Bax蛋白比值增加，神經細胞凋亡率下降，神經功能缺損評分降低，且在較多的檢測時間點上高劑量組各指標均明顯優于低劑量組，表現出一定的量效關系。綜上所述，槲皮素對腦出血大鼠干預后可通過提高Bcl-2蛋白表達、降低Bax蛋白表達，使Bcl-2/Bax蛋白比值增加，從而降低神經細胞凋亡，減輕神經功能損傷，對腦出血表現出一定的治療效果和應用前景。

參考文獻

[1] LI L， KE K， TAN X， et al. Up-regulation of NFATc4 involves in neuronal apoptosis following intracerebral hemorrhage[J]. Cellular and Molecular Neurobiology， 2013， 33（7）：893-905.

[2] ZHANG Y， YI B， MA J， et al. Quercetin promotes neuronal and behavioral recovery by suppressing inflammatory response and apoptosis in a rat model of intracerebral hemorrhage[J]. Neurochemical Research， 2015， 40（1）：195-203.

[3] BAHAR E， KIM J Y， YOON H. Quercetin attenuates manganese-induced neuroinflammation by alleviating oxidative stress through regulation of apoptosis， iNOS/NF-κB and HO-1/Nrf2 pathways[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2017， 18（9）：1-19.

[4] HUBBARD G P， WOLFFRAM S， LOVEGROVE J A， et al. Ingestion ofquercetin inhibits platelet aggregation and essential componentsof the collagen-stimulated platelet activation pathway in humans[J]. Journal of Thrombosis Haemostasis： JTH， 2004， 2（12）： 2138-2145.

[5] ROSENBERG G A， MUN-BRYCE S， WESLEY M， et al. Collagenase induced intracerebral hemorrhage in rats[J]. Stroke， 1990， 21（5）：801-807.

[6] SCHALLERT T， FLEMING S M， LEASURE J L， et al. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke， cortical ablation， parkinsonism and spinal cord injury[J]. Neuropharmacology， 2000， 39（1）：777-787.

[7] HENGARTNER M O. The biochemistry of apoptosis[J]. Nature， 2000， 407（6805）：770-776.

[8] LIU Z C， MENG L Q， SONG J H， et al. Dynamic protein expression of NF-κB following rat intracerebral hemorrhage and its association with apoptosis[J]. Experimental and Therapeutic Medicine， 2018， 16（5）： 3903-3908.

[9] WANG Z， ZHOU F， DOU Y， et al. Melatonin alleviates intracerebral hemorrhage-Induced secondary brain Injury in rats via suppressing apoptosis， inflammation， oxidative stress， DNA damage， and mitochondria injury[J]. Translational Stroke Research， 2018， 9（1）： 74-91.

[10] CHEN J C. The effects of acupuncture and traditional Chinese medicines on apoptosis of brain tissue in a rat intracerebral hemorrhage model[J]. Physiology & Behavior， 2015，1（151）：421-425.

[11] SAVITSKAYA M A， ONISHCHENKO G E. Mechanisms of Apoptosis[J]. Biochemistry（Moscow）， 2015， 80（11）：1393-1405.

[12] VOLKMANN N， MARASSI F M， NEWMEYER D D， et al. The rheostat in the membrane： BCL-2 family proteins and apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation， 2014， 21（2）：206-215.

[13] KUMARI A， KAKKAR P， et al. Lupeol prevents acetaminopheninduced in vivo hepatotoxicity by altering the Bax/Bcl-2and oxidative stress-mediated mitochondrial signaling cascade[J]. Life Sciences， 2012， 90（15/16）：561-570.

[14] WANG X. The expanding role of mitochondria in apoptosis[J]. Genes & Development， 2001， 15（22）：922-933.

[15] CHENG E H， WEI M C， WEILER S， et a1. BCL-2， BCL-X（L） sequester BH3 domain-only molecules preventing BAx-and BAK-mediated mitochondrial apoptosis[J]. Molecular Cell， 2001， 8（3）：705-711.

[16] LU H， SHEN J， SONG X， et al. Protective effect of pyrroloquinoline quinone （PQQ） in rat model of intracerebral hemorrhage[J]. Cellular and Molecular Neurobiology， 2015，35（7）：921-930.

[17] CHEN J C. The effects of acupuncture and traditional Chinese medicines on apoptosis of brain tissue in a rat intracerebral hemorrhage model[J]. Physiology & Behavior， 2015，1（151）：421-425.

[18] ZHI G C， QIAO L Y， GUANG R X， et al. Effects of quercetin on proliferation and H2O2-Induced apoptosis of intestinal porcine enterocyte cells[J]. Molecules， 2018， 23（8）：1-25.

[19] BAHAR E， KIM J Y， YOON H. Quercetin attenuates manganese-induced neuroinflammation by alleviating oxidative stress through regulation of apoptosis， iNOS/NF-κB and HO-1/Nrf2 pathways[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2017， 18（9）：1-19.

（本文編輯? 蘇? 維）