強還原土壤滅菌研究進展①

朱文娟，王小國

(1 中國科學院成都山地災害與環境研究所，成都 610041；2 中國科學院大學，北京 100049)

同一種作物或近緣作物連作后，即使采用正常的栽培管理措施也會發生產量降低、品質變劣、生育狀況變差的現象，這一現象即是連作障礙[1]。許多大田經濟作物、園藝作物(包括瓜果類蔬菜和觀賞花卉)和中草藥材等的種植都存在著不同程度的連作障礙現象[2-4]。由于地理特點、氣候條件及種植習慣等因素的影響，我國相繼出現了一批專業化的經濟作物(藥材)種植區，如東北大豆種植區、山東花生種植區、海南甘蔗種植區、四川中藥材種植區等。大田經濟作物(藥材)一般都采用大面積連年種植的形式，隨著市場需求的不斷上升，這些作物的栽培面積不斷擴大，由此造成更大面積的連作。連作常使作物(藥材)生長不良，病蟲害發生嚴重，從而造成作物產量下降、品種質量變劣、經濟效益降低[5-6]。為防治連作障礙，常采取的措施有物理措施(如輪作、間作套種、灌溉洗鹽、高溫悶棚等)、生物措施(如施用微生物有機肥、施用拮抗劑和選用抗性品種等)以及化學措施(如施用石灰增加pH、土壤化學熏蒸等)[7]。這些方法和技術對連作障礙具有一定防治和減緩效果，但這些技術均有其局限性。例如，施用生物有機肥或增施有機肥，一般情況下只起緩解連作障礙的作用；施用石灰可調節土壤酸度，卻不一定能減少土壤中土傳病原菌數量；施用甲基溴類化學熏蒸劑是控制土傳病菌較有效的方法，但由于對環境產生負面影響已被禁止使用[8-9]。

因此，需要解決的連作障礙技術存在的問題是：可用的、防治結合的物化技術和保護農地廢棄物再利用技術較少，全面修復土壤物理、化學和生物性質的方法不多[6]。最近國外剛剛興起的強還原土壤滅菌(reductive soil disinfestation，簡稱RSD)方法是運用生態學方法，在土壤-作物-微生物的關系中創造有利于作物生長、不利于病原微生物生長的土壤環境條件，以達到降低土傳疾病的發生率、提高作物產量的目的[10-12]。RSD 處理具體步驟包括：①添加有機物質。采用粉碎機直接或相對高溫(40 ～ 60℃)烘干后粉碎過篩，將粉末狀有機物料均勻翻耕入土，或采用灌溉設備將乙醇等液體有機物質施用到土壤；②淹水覆膜；③當土壤不再產生惡臭味時處理結束，撤膜排水晾干土壤[10]。該技術的基本原理是：在短時間內創造強烈的土壤還原環境，利用反硝化反應以消除積累在土壤中的硝酸鹽，生成硫化氫等還原性硫化物而脫除硫酸鹽，從而達到脫鹽的目的；利用還原過程中產生的OH－以中和土壤酸性；短時間內強烈的氧化還原條件轉變及還原環境中生成的H2S 等物質可能抑制甚至殺滅土傳病原微生物；有機物料轉化生成的土壤有機質將改變土壤的物理性質，從而徹底修復退化土壤，為作物創造良好的生長環境[8-10]。

RSD 方法是近年來代替化學熏蒸滅菌的土壤消毒處理方法[8-10]。該方法較其他土壤處理方法，其優點明顯：①耗時短、效率高。傳統土壤淹水處理需3 ～ 4 個月，該方法僅需2 ～ 4 周，即可有效殺滅90%以上的病原菌；②所需溫度較低。日曬消毒往往需要40 ～ 55℃的持續高溫才能在較短時間內有效殺滅病原菌，僅局限在日曬強烈的熱帶地區和亞熱帶沿海地區，相比之下，RSD 方法只需25℃以上溫度；③物料選擇范圍寬。作物秸稈、麥麩、乙醇、覆蓋作物、綠肥和糞肥等均可作為有機物料翻入土壤；④環保，基本無污染。化學消毒常采用溴甲烷等作為土壤熏蒸劑，嚴重破壞環境，引起溫室效應等，強還原土壤滅菌方法充分利用農副產品廢棄物，既可實現土壤消毒滅菌，又能部分解決農田廢棄物污染問題[8-10]。

1 強還原土壤滅菌(RSD)的應用

RSD 處理中添加的有機物料(碳源)可分為干物質有機物料和和易降解液體化合物[11]。干物質有機物料包括作物秸稈、作物殘渣等農業廢棄物，易降解液體化合物主要包括乙醇、乙酸和葡萄糖等。

1.1 干物質有機物料作為碳源

1.1.1 干物質有機物料種類 易降解的有機物料作為碳源添加，已被證明具有良好的滅菌效果，主要包括苜蓿、麥麩、米糠、玉米秸稈、甘蔗渣、稻殼、蘆葦等農業廢棄物，雞糞、豬糞等家禽糞肥，西蘭花、芥菜、芝麻菜等新鮮覆蓋作物[10,13-14]。這些有機物料都易大量獲取，RSD 處理將其作為碳源，可同時起到降低處理成本、利用有機廢棄物、保護生態環境的作用[10]。

大部分有機物料都取得了較好滅菌的效果，但是呈現出差異性，這與有機物料本身理化性質有很大關系。有機物料富含豐富有機碳，可分為易降解和難降解(如纖維素和木質素)兩種[11]。RSD 處理前期厚壁菌門(Firmicutes)利用有機質大量繁殖并成為優勢種群，其中優勢屬中碳源分解者瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和產酸菌(如Clostridia和Coprococcus)居多。有學者推測，RSD 處理前期碳源分解者能夠快速分解物料中的易降解有機碳并協同產酸菌產生有機酸，后期有機質中剩余部分為難降解有機碳源，微生物分解緩慢，從而產酸能力也較弱[11-12]。這些有機物料降解過程產生的有機酸正是滅菌最為重要的物質，但由于物料易氧化有機碳含量不同，產生有機酸的能力高低不一。此外，RSD 處理過程產生的有益菌等(如芽胞桿菌Bacillus)利用易降解有機碳源大量繁殖，這些有益微生物的拮抗作用、競爭作用及寄生作用能較好地抑制病原菌[10-11]。在易氧化有機碳大致相同的情況下，總氮越高，殺菌效果越好。這可能與氨化作用有關，微生物分解有機氮過程中產生的有毒物質氨具有殺菌作用，總氮越高氨化作用強度越大，產生的氨也越多，從而殺菌效果也越好[11]。

目前已采用的農業有機物料碳氮比(C/N)比值范圍在6.99 ～ 159.23，例如苜蓿、麥麩、米糠、菜粕、玉米秸稈等為低C/N 有機物料，甘蔗渣和甘蔗葉等為高C/N 有機物料。但是，低C/N 的有機物料具有更高的滅菌速率，能促使土壤發生較高的還原條件，導致土壤中含氮化合物(如氨和亞硝酸)的生成量增加，從而更好抑制真菌病原體[11,16]。在美國田納西洲RSD 實施方法中，建議施用C/N 為10 ～ 35 的有機物料，他們認為RSD 處理采用的有機物料C/N 過低會導致氮的損失，而過高的C/N 則使處理后的土壤出現缺氮情況，需要施用更多的氮肥加以補充[10]。也有研究表明，有機物料的C/N 在10 ～ 40 的范圍內可有效地減少病菌菌核的萌發并增強有益菌核體寄生菌的定殖[17]。總的來說，添加高易氧化有機碳和低C/N有機物料所參與的RSD 處理滅菌效果更好[16]。

1.1.2 干物質有機物料作為碳源的應用 1) 枯萎病防治。尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)是一種廣泛分布的土傳病原真菌，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100 多種植物枯萎病的發生[18]。例如，何欣等[19]報道指出每克土含103CFU 的尖孢鐮刀菌就是香蕉枯萎病的致病濃度。RSD 處理對尖孢鐮刀菌具有良好殺滅效果，已經成功防治多種作物、水果枯萎病，例如香蕉、洋桔梗、黃瓜、西瓜、番茄、草莓、菠菜等。其中采用的碳源分別有苜蓿粉、米糠、麥麩、蘆葦、甘蔗葉、甘蔗渣、芥菜、蘿卜殘茬、稻草、新鮮豬糞等(表1)。RSD 處理的土壤處理溫度為19.7 ～ 40℃，處理時間一般為9 ～ 27 d，土壤溫度越高，RSD 處理時間越短，而處理溫度較低時，需要較長的處理時間，具體處理時間可根據有機物料的施用量、溫度、土傳病原菌數量及可供處理的有效時間做調整。RSD 處理的有機物料施用量一般為0.31 ～10.2 kg/m2(表1)。一般而言，有機物料施用量越大，滅菌效果越顯著，但黃新琦等[12]以水稻秸稈處理香蕉尖孢鐮刀菌高度侵染的土壤時，發現施用量為土壤質量的0.6% 和1.2% 時，殺菌效果并無顯著差異。RSD 處理通過淹水和覆膜處理可將土壤與大氣隔絕，快速建立強還原環境，而對于少部分持水能力差或不便淹水處理土壤，可選擇覆膜，透明塑料膜有利于日曬和提高土壤溫度，不透明膜對控制雜草有一定作用[11,14]。

表1 RSD 防治枯萎病所采用的干物質有機物料Table 1 Dry organic matter used by RSD to prevent Fusarium oxysporum wilt

麥麩作為RSD 處理的碳源對尖孢鐮刀菌有較好滅菌效果，已被國內外科技工作者廣泛采用[16,21-22]。Momma 等[21-22]研究報道，在日本溫室控制試驗下，以麥麩為碳源的RSD 處理能致使菠菜枯萎病發病率降低至21.1%，有效防治由尖孢鐮刀菌引起的菠菜枯萎病。Momma 等[22]研究還發現，在同樣溫室控制試驗下，以麥麩為碳源的RSD 處理可降低接種至土壤中的番茄枯萎病菌厚垣孢子的活力，然而在田間條件下施用1 kg/m2麥麩進行RSD 處理，處理15 d 時間后卻沒有獲得與在溫室控制試驗下接種番茄枯萎病菌相似的滅菌效果，并認為這可能是與所添加碳源的來源不同或其他添加物質有關。相反，阿根廷科學家Yossen 等[23]研究發現，在田間條件下對自然侵染尖孢鐮刀菌的康乃馨溫室，以上述相似土壤處理溫度(30℃以上)且相同施用量(1 kg/m2)的麥麩進行RSD處理，尖孢鐮刀菌顯著減少，康乃馨枯萎病得到有效防治。國內，蔡祖聰等[10]、劉亮亮等[16]研究RSD 處理所使用有機物料與其殺菌效果的相互關系發現，低C/N 麥麩中易氧化有機碳含量高，易降解且刺激有機酸生產者產生更多的有毒有機酸，加之C/N 較低可能會誘發較高的滅菌速率，從而在RSD 過程呈現較好的滅菌效果，同樣包括苜蓿、蘆葦、水稻秸稈、玉米秸稈、香蕉葉、甘蔗葉和甘蔗渣等有機物料。除單獨施用有機物料外，Zhou 等[20]在發生嚴重枯萎病的西瓜地，聯合施用苜蓿粉和0.25% 冰乙酸，結果表明新栽幼苗死亡率降低至0，土壤中尖孢鐮刀菌、真菌、放線菌顯著降低，顯著控制西瓜枯萎病發生和提高西瓜產量，值得推廣應用。

能夠產生殺菌物質的十字花科植物也是很好的有機物料[10]。蘿卜殘茬和芥菜均屬于十字花科植物，當添加進土壤后均會釋放對病菌具有較好殺滅效果的揮發性有機物(含有異硫氰酸鹽)，均能顯著殺滅尖孢鐮刀菌[10,25-28]。尤其以蘿卜殘茬為碳源進行RSD處理，處理后土壤中細菌群落以梭菌屬(Clostridia)和桿菌屬(Bacillus)微生物為主，大大增加了土壤中的梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌等有益微生物，這些有益微生物菌群能拮抗和抑制土壤中病原菌，有效防治枯萎病發生[25-28]。

新鮮覆蓋作物也可用作RSD 處理的碳源殺滅尖孢鐮刀菌，如豇豆、菽麻、珍珠粟(也稱為御谷)和高粱-蘇丹草(高粱×蘇丹草雜交)等[29]。Bulter 等[29]以新鮮覆蓋作物為RSD 處理的碳源發現，以豇豆與珍珠粟組合、高粱-蘇丹草為碳源均可控制接種到溫室土壤中的番茄枯萎病菌和齊整小核菌，其中尖孢鐮刀菌的死亡率相似，均減少了97% 以上，但是對接種的齊整小核菌病原體的滅菌效果不一致。雖然新鮮覆蓋作物是一種潛在且有效的碳源物質，但是仍需要進一步驗證其滅菌效果及其一致性[29]。

同時，采用RSD 處理防治枯萎病后，土壤中SO2–4和NO–3含量均降低，解決了硝酸鹽和硫酸鹽累積造成的次生鹽漬化問題，也能改善土壤板結和減少土壤酸化發生[30-32]。低C/N 有機物料具有較好滅菌效果，但是在蔬菜大棚由于大量施用氮肥，常積累大量硝態氮，相反施用C/N 高的秸稈作為有機物料可以促進硝態氮的生物同化，減少氮素損失[10]。

2)立枯病防治。土傳立枯病又稱“死苗”，主要由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)引起，寄主范圍廣，除茄科、瓜類蔬菜外，一些豆科、十字花科等蔬菜也能被害，其是各種作物中產生猝倒病的主要原因[33]。這種真菌即使在不利的環境條件下也會以菌核-休眠形式長期存活[34]。

目前，苜蓿、米糠、芝麻菜、芥菜、西蘭花等作為RSD 處理的碳源，已成功用于黃瓜、番茄和紅甜椒等立枯病的防治[35-37]。RSD 處理的溫度為18 ～30℃，處理時間一般為15 ～ 21 d(表2)。盆栽試驗RSD處理施用2% 土壤質量的有機物料取得較好滅菌效果。在美國田納西洲，RSD 實施方案最初建議的有機物料施用量為0.4% 土壤質量的有機碳，但這是以致死各種土傳病原菌為目標的施用量，如果需要致死的土傳病原菌對RSD 處理較為敏感，則有機物料的施用量可適當減少[10]。

對感染立枯絲核菌的黃瓜連作地進行盆栽RSD處理，施用土壤質量2% 的苜蓿粉，土壤灌溉至水分飽和并覆蓋塑料膜，土壤控溫在30℃左右處理19 d，結果表明立枯絲核菌種群數量顯著降低，且土壤微生物的群落多樣性和活性顯著增加[36]。微生物拮抗劑也是防治立枯病的措施之一，但由于拮抗微生物與土壤微生物存在競爭關系不能在土壤中穩定定殖，滅菌效果不佳[36]。Huang 等[37]通過微生物拮抗劑與RSD 方法聯合應用，即在RSD 處理結束后進一步接種微生物拮抗劑(短小芽孢桿菌和哈茨木霉)，結果發現由于前期RSD 處理減少了立枯絲核菌數量，拮抗微生物能通過RSD 創造的有利空間和所提供的營養，更穩定定殖于土壤。相對單獨施用拮抗劑或RSD 處理，二者配合施用不僅增加土壤微生物數量和活性，也進一步改變土壤微生物的結構，更穩定控制立枯病發生[35-37]。

McCarty 等[35]研究發現，在美國田納西州受立枯絲核菌侵染的番茄和甜椒土壤上，分別以黑麥、芥菜+芝麻菜、干糖渣為碳源進行RSD 處理，其中黑麥、芥菜+芝麻菜處理土壤中立枯絲核菌種群數量最低，并且與生物熏蒸的滅菌效果相當。這可能是由于黑麥為低C/N 有機物料，強還原環境下易于被土壤微生物降解利用，從而產生大量有毒有機酸殺滅病原菌[10,35]；而芥菜和芝麻菜屬十字花科植物，添加到土壤會釋放揮發性殺菌物質[10]。然而，田間條件下，RSD 處理后番茄和甜椒的產量與未處理土壤沒有顯著差異[35]。McCarty 等[35]認為這與處理前土壤感染立枯絲核菌數量相對少，作物發生立枯病程度較輕有關，并且RSD 處理中碳源施用量少，處理前后土壤肥力相當，因此造成作物產量沒有顯著差異。雖然RSD處理過程中施用大劑量有機物料能更好地抑制病菌[10]，但是Utsala 等[38]研究指出，僅用禾本科(青草)和十字花科植物對感染立枯絲核菌土壤進行RSD 處理時，施用5 ～ 6 kg/m2的有機物料卻表現出對病原菌較小的抑制作用，具體原因需進一步研究。

表2 RSD 防治立枯病所采用的干物質有機物料Table 2 Dry organic matter used by RSD to prevent Rhizoctonia solani

3)黃萎病防治。大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)是引起黃萎病的致病菌，大田作物包括棉花、茄子、番茄、煙草、甜瓜、西瓜、黃瓜等易受侵害[39]。通過分別采用麥麩、黑麥草、西蘭花和米糠等作為RSD 處理碳源，均顯著控制黃萎病的發生[8,40-45]。RSD 處理溫度為15 ～ 26.6℃，有機物料施用量為1 ～ 10.2 kg/m2，處理時間一般為3 ～ 13周(表3)。

表3 RSD 防治黃萎病所采用的干物質有機物料Table 3 Dry organic matter used by RSD to prevent Verticillium wilt

RSD 處理防治黃萎病所采取的有機物料中，低C/N 的米糠和麥麩均是優質的碳源。Daugovish 等[40]報道，以米糠為碳源進行RSD 處理，可將土壤接種的大麗輪枝菌病原體減少94%。Shennan 等[41-42]研究發現，對發生黃萎病的草莓園土壤進行RSD 處理，在土壤溫度為16 ～ 21.1℃條件下，施用2.02 kg/m2米糠需處理6 周；而相同土壤溫度條件下，通過施用2.48 kg/m2麥麩進行RSD 處理，處理3 周后即顯著殺滅大麗輪枝菌，控制草莓黃萎病的發生且提高了水果產量；然而，土壤處理溫度升高至21.1 ～ 26.6℃時，在土壤中僅施用1.08 kg/m2米糠，處理4 周就達到相同滅菌效果。Shennan 等[42]及Wen 等[43]研究表明，土壤溫度高于17℃，施用2 kg/m2米糠作為碳源進行RSD 處理，草莓園土壤中自然侵染的大麗輪枝菌的數量可減少85% ～ 100%，并且RSD 處理后的草莓產量與聯合施用1,3-二氯丙烯+氯化苦的土壤熏蒸滅菌效果相當。同樣，Muramoto 等[44]以米糠為碳源，在20 ～ 23℃的土壤溫度下，以2 kg/m2米糠施用于自然感染大麗輪枝菌的草莓園土壤，也取得了顯著滅菌效果。Utsala 等[38]對不同溫度條件下RSD 處理的時間和滅菌的效果進行Meta 分析發現，室內控制試驗或田間試驗條件下，所有RSD 處理在較高的土壤處理溫度下更能發揮其有效性，當土壤溫度相對高時(＞16℃)，處理時間可縮短至3 周以下，當溫度為16 ～ 30℃時病原體抑制率達到80% 以上；但是較低溫時，40%病原體未被抑制。然而，在低溫(＜16℃)條件下，當改變某些條件時RSD 可能有效，例如添加較高施用量的有機物質和進行較長時間的處理(10 ～ 25 周)，低溫下的RSD 處理可有效控制土壤中大麗輪枝菌[38]。

新鮮西蘭花和黑麥草也常作為RSD 處理碳源，對大麗輪枝菌有較好滅菌效果。在荷蘭的田間條件下， Blok 等[45]在土壤15 cm 土層深度接種大麗輪枝菌、立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌，通過施用0.5 kg/m2的西蘭花，在39℃土壤溫度覆膜處理15 周，結果表明3 種病原體的接種物均失活，病原菌數量均顯著降低，滅菌效果顯著。同樣在荷蘭，Goud 等[46]在感染大麗輪枝菌的挪威楓和美國紅豆樹土壤中施用4 kg/m2或5.4 kg/m2黑麥草覆膜處理10 ～ 13 周，結果表明相對未處理土壤，RSD 處理直接減少接種到土壤中85%的大麗輪枝菌，且病原菌在4 a 內沒有再增加，黃萎病的危害程度降低，植株的死亡率減少。但是相比米糠和麥麩，新鮮西蘭花和黑麥草作為RSD 處理碳源，處理時間均偏長，但均對病原菌具有滅菌效果。

4)根腐病和根結線蟲防治。根腐病是一種真菌引起的病害，該病易造成根部腐爛，使其吸收水分和養分的功能逐漸減弱，最后全株死亡。引起根腐病的病原菌包括疫霉、腐霉、鐮刀菌等[47]。目前RSD 已用于蘆蒿、蘋果、核桃、李樹等根腐病的防治[47-51]。已采用的有機物料包括玉米秸稈、米糠、鴨茅和芥菜等。RSD 處理時間一般為2 ～ 7 周，處理溫度一般為18 ～ 35℃(表4)。

Wen 等[43]對蘆蒿根腐病土壤進行盆栽RSD 處理，在盆缽中施用土壤質量0.2% ～ 2% 的玉米秸稈粉(玉米地上部分在40℃烘干磨成)，結果表明，RSD 處理后土壤蘆蒿根腐病得到顯著抑制，土壤中有機物料施用量越高，滅菌效果越好，尤其施用2% 秸稈的土壤中細菌群落結構顯著轉變，土壤細菌多樣性增加。并且，未完全降解的有機物料殘留在土壤中，增加了土壤有機質含量[47]。Messiha 等[48]研究RSD 處理對馬鈴薯根腐病的滅菌效果時發現，以青草葉為碳源對接種和自然侵染褐腐病菌的馬鈴薯土壤進行RSD 處理，在使用青草葉的微區試驗中病原體的數量減少了92% 以上，并且在田間試驗中，病原體種群仍然顯著減少。

RSD 方法也用于疫霉和腐霉等根腐病致病菌頻發的果園[48-51]。在嚴重受終極腐霉侵染的核桃樹土壤施用15.7 t/hm2米糠，覆膜處理7 周，存活在7.6 ～ 15.2 cm 土壤深度的終極腐霉菌數量均下降至檢測水平以下，并且還能降低寄主范圍廣和易導致植株干枯死亡的根癌農桿菌數量[49]。在感染腐霉的李樹土壤施用2 kg/m2米糠進行RSD 處理，可將土壤中腐霉幾乎消滅，顯著促進李樹的生長，樹干橫截面積平均增長率在37% ～ 264%[50]。在發生根腐病的蘋果幼苗土壤，以鴨茅和芥菜作為碳源進行RSD 處理均顯著降低蘋果樹腐霉根的感染率，可有效防治蘋果幼苗發生根腐病[51]。

根結線蟲(Meloidogyne)，也是常見根部致病菌，由于在根部形成球形或圓錐形大小不等的白色根瘤或呈念珠狀病菌，嚴重影響作物生長[52]。其主要寄生在蔬菜、糧食作物、經濟作物、果樹、觀賞花卉及雜草上[53]。然而，RSD 處理對根結線蟲的殺滅效果可達100%[10]，已采用的有機物料包括黑麥草、麥麩、米糠、糖蜜和雞糞堆肥等(表4)。RSD 處理溫度為15 ～ 40℃，有機物料施用量為0.46 ～ 4 kg/m2，處理時間一般為2 ～ 13 周。Utsala等[38]研究不同溫度條件下RSD 處理對線蟲的滅菌效果時發現，RSD 處理的土壤溫度在16 ～ 35℃條件下對線蟲抑制作用最大，而在較高(＞35℃)和較低(＜16℃)溫度下抑制作用不顯著；同時RSD 處理時間小于2 周顯著促進線蟲的存活，而處理4 ～ 6周對線蟲具有較高的抑制作用。

Katase 等[54]以麥麩為RSD 處理碳源，在根結線蟲嚴重的草莓園土壤施用2 kg/m2，土壤溫度35℃處理24 d 顯著控制了病害發生；Goud 等[46]以黑麥草為碳源，在移動型短體線蟲屬和毛刺線蟲屬頻發的挪威楓樹和美國木豆樹土壤上，施用0.46 kg/m2并進行覆膜處理10 ～ 13 周，RSD 處理后可顯著減少根結線蟲數量，降低發病率，而且這種土壤病菌種群的減少也致使樹木根部感染的病菌顯著減少，但由于樹種根系發達和侵染范圍廣，處理時間可能較長。此外，Lamers等[55]研究發現，以綠肥作為RSD 處理的碳源，處理后根結線蟲和馬鈴薯胞囊線蟲顯著減少；Bulter等[56-57]報道，以糖蜜、糖蜜和雞糞堆肥為碳源對發生根結線蟲的茄子地塊進行RSD 處理，第二季生長的茄子其根部和土壤中的根結線蟲群落顯著減少，但在同一研究中隨著雞糞堆肥的施用，土壤中非致病菌線蟲數量增加。類似地，Rosskopf 等[58]研究指出，在發生根結線蟲的草莓園以糖蜜和雞糞堆肥為碳源進行RSD 處理，非致病菌線蟲增加且數量隨時間變化較大。

表4 RSD 防治根腐病或根接線蟲所采用的干物質有機物料Table 4 Dry organic matter used by RSD to prevent root rot or Meloidogyne

5)青枯病防治。青枯病病原菌為茄科勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)[59]，主要危害作物有番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等。目前，以米糠、麥麩和茶籽麩為碳源的RSD 處理，已被證明對茄科勞爾氏菌有著顯著殺滅效果，有機物料施用量為1 kg/m2，處理時間為14 ～ 27 d(表5)。

水稻-番茄輪作5 a 以上土壤青枯病發病率達45%，對發病土壤施用量1 kg/m2米糠、1 kg/m2麥麩和1 kg/m2茶籽麩，灌溉至土壤飽和并室外曝曬27 d，結果表明3 種有機物料作為碳源均顯著減少土壤中青枯菌數量，且米糠、麥麩、茶籽麩處理青枯病發病率分別降低42.65%、40.41% 和29.41%[60]。此外，RSD 處理后均能提高土壤pH 和電導率，有效防治土壤酸化，也同時增加了土壤有機質、全氮、堿解氮和速效鉀含量，明顯改善土壤養分條件[60]。以上3 種有機物料，低C/N 的麥麩作為RSD 的碳源，在提高土壤pH、防控青枯病及提高產量方面表現較好的優勢[52]。此外，Momma 等[61]研究發現，以麥麩為碳源的RSD 處理可降低由青枯雷爾氏菌引起的番茄青枯病的病害程度。

表5 RSD 防治青枯病所采用的干物質有機物料Table 5 Dry organic matters used by RSD to prevent bacterial wilt

6)疫病防治。植物疫病，主要指由疫霉屬(Phytophthora)真菌引起，其表現為葉斑、冠腐、枝干潰瘍和腐爛、幼苗猝倒、根莖腐等[62]。對農業威脅較大的疫病主要有由致病疫霉(P. infestans)引起的馬鈴薯晚疫病、番茄晚疫病，由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)引起的辣椒疫病等[15,63-64]。而RSD 已經成功治理發生辣椒疫病土壤，在防治植物疫病方面表現出較大潛力。

Serrano-Pérez 等[65]研究RSD 處理對辣椒疫霉菌的存活率和侵染情況發現，以米糠、油菜籽粕、葡萄渣為RSD 處理碳源，對接種煙草疫霉的土壤進行田間試驗和室內試驗，與對照相比，均有效地降低了煙草疫霉的感染率和存活率，田間條件下辣椒植株的煙草疫霉感染率均低于50%，而在室內試驗中均低于20%。王光飛等[15]對發生辣椒疫病土壤地進行盆栽RSD 處理，以水稻秸稈和菜粕作為碳源，分別施用土壤質量的0.6% 和2%，然后土壤灌溉至飽和，土壤控溫28℃對土壤處理20 d，結果表明幼苗栽種45 d后，對照、菜粕處理和水稻秸稈處理發病率分別為16.7%、3.3%、0%[15]。由于水稻秸稈和菜粕是生產上都易大量獲取但性狀差異較大的兩種農業有機廢棄物，水稻秸稈是高碳含量有機物料，腐解過程中產生的大量有機酸和酚酸等物質對病原菌生長具有抑制作用，而菜粕含氮量較高，腐解過程產生的氨氣等含氮化合物對病原菌具有較強的殺滅效果[15]。但就對辣椒疫霉的滅菌效果而言，菜粕作為RSD 處理的碳源不能徹底減少辣椒疫霉，應用可能存在風險，而水稻秸稈在殺滅病菌和真菌等方面表現突出，是較為優選的碳源。

1.2 液體有機物質作為碳源

1.2.1 液體有機物質種類 干物質有機物料作為RSD 處理碳源，已經被成功用于防治土傳病原菌和土地退化引起的連作障礙[10]。但由于固體有機物料不易下滲，只能機械翻耕至淺層土層，而寄主在深層土壤中的病菌往往不能殺滅[9]。然而，液體有機物質作為碳源可解決這個問題，通過滴灌或噴灑更容易施用于土壤中。目前，乙醇、生物乙醇、冰乙酸、葡萄糖等易降解有機化合物已被用于RSD(表7)。

1.2.2 液體物質作為碳源的應用 采用液體有機物質作為RSD 處理碳源添加劑，對防治香蕉和番茄枯萎病、黃瓜立枯病、草莓黃萎病、蘋果根結線蟲等，均取得了良好的滅菌效果(表7)。

表6 RSD 防治疫病所采用的干物質有機物料Table 6 Dry organic matter used by RSD to prevent epidemic disease

表7 液體有機物質作為碳源應用情況Table 7 Liquid organic matter used as C source

乙醇作為RSD 處理中常選用的液體碳源，可顯著提高RSD 有效性，且不管是室內還是田間條件進行RSD 處理，均對多種病原真菌具有殺滅效果[22,38]。Hewavitharana 等[66]研究發現，在室內控制試驗條件下，通過施用濃度為10% 乙醇覆膜處理2 周，蘋果連作土腐霉屬、穿刺根腐線蟲均被抑制；Momma 等[22]研究報道，同樣在室內試驗條件下，以麥麩為RSD處理碳源，最少需處理9 d 才能致使番茄枯萎病菌(尖孢鐮刀菌)的厚垣孢子死亡，而通過施用不同濃度乙醇，可顯著縮短處理時間，例如 2% 的乙醇需處理3 d，1% 的乙醇需處理6 d，5% 的乙醇需處理9 d即可使病原體達到不可檢測水平[9]。而在田間試驗條件下，以1% 乙醇溶液對接種和自然侵染的番茄枯萎病菌(尖孢鐮刀菌)土壤進行RSD 處理，結果表明病原菌數量均顯著降低[9]。Goud 等[46]報道在感染大麗輪枝菌的草莓土壤上，處理溫度21.1 ～ 26.6 ℃條件下，以 1% 乙醇且100 ml/m2施用量灌溉田塊，處理4 周后病原菌數量顯著減少。

高濃度乙醇雖然滅菌效果顯著、處理時間短，但是濃度略偏高往往對土壤產生不利影響。根據目前已有的試驗研究結果，可能增加土壤處理溫度可降低乙醇施用濃度。例如，在土壤控溫30℃條件下，對發生立枯病黃瓜土壤施用1% 乙醇處理19 d，待土壤排水落干后種植黃瓜幼苗，幼苗發芽率高達92.6%[36]；相同土壤溫度下，對番茄枯萎病土壤施用濃度為0.5% ～ 1% 乙醇或1% 生物乙醇，土壤中尖孢鐮刀菌均減少，滅菌效果顯著[67]。用乙醇作為RSD處理的有機物質時，Momma 等[9-10]建議用1% 濃度的乙醇作為標準施用量，但具體施用量以土壤病原菌侵染程度、處理溫度等綜合考慮。

廢糖蜜作為制糖廠的一種副產品，也常用作RSD處理的液體碳源，且已在日本和美國廣泛使用[56-70]。Butler 等[56-57]研究發現，在接種根結線蟲和辣椒疫霉的茄子和甜椒土壤上，以糖蜜為碳源進行RSD 處理，不僅將寄主在土壤中病菌顯著殺滅，也增加了土壤無機氮含量，提高土壤養分條件。然而，Zavatta 等[68]報道指出，在美國加利福尼亞草莓園單獨使用糖蜜為碳源進行RSD 處理不如以米糠為碳源有效，并且不誘導土壤微生物群落的轉變，而用米糠進行RSD 處理后觀察到明顯不同的微生物群落變化。糖蜜也常與雞糞堆肥組合作為RSD 處理碳源進行應用，例如在美國佛羅里達州，使用雞糞堆肥和糖蜜組合為RSD處理碳源，已成功防治辣椒疫霉、番茄枯萎病菌、大豆炭腐病、草莓炭疽病等[58,69-70]。也有研究表明，以糖蜜為碳源且同夏季日曬相結合進行RSD 處理，對埋藏在土壤中的尖孢鐮刀菌和腐霉接種物的滅菌效果顯著，且與甲基溴熏蒸滅菌效果相當[68]。

除常采用的乙醇和廢糖蜜外，低濃度液體乙酸、葡萄糖作為碳源也具有良好殺菌效果。例如，對西瓜枯萎病土壤，施用濃度為0.25% 的冰乙酸，并進行覆膜處理21 d，結果表明RSD 處理均顯著減少土壤中尖孢鐮刀菌數量[20]；并且待RSD 處理結束，土壤排水晾干后種植西瓜幼苗，乙酸處理死苗率為0，顯著低于對照土壤43.3% 死苗率[20]。此外，對洋桔梗枯萎病施用土壤質量2% 的葡萄糖，土壤控溫35℃覆膜處理 14 d，土壤中尖孢鐮刀菌滅菌率為85.87%[11]。但是目前乙酸及葡萄糖較少作為RSD 處理碳源，仍需進一步深入研究。

液體物質作為碳源具有縮短滅菌時間、增加滅菌深度等優勢，但是添加干物質有機物料可能更能改善土壤養分條件。液體物質作為碳源，應用成本高是目前最關心的問題[58]。所以，為了使這種有效的滅菌方法廣泛應用，需要一個穩定的低成本乙醇供應系統，或者利用生物乙醇。生物乙醇作為是一種可再生能源，可以通過甘蔗、玉米、大米、小麥和高粱等農業原料生產制成，值得推廣應用[67]。

2 結語

RSD 法是具有廣譜性、環境友好型的方法，RSD重建的微生物種群和群落使土壤比以往更具有抑制病害的能力，并且具有提高土壤pH、改善土壤養分循環和土壤結構等優點，可有效治理多種土傳病真菌病原體侵染和土壤理化性質退化造成的連作障礙。

篩選優質碳源是RSD 法成功的關鍵。根據目前所采用的有機物質類型及其呈現的滅菌效果和土壤修復效果，麥麩、苜蓿、米糠、玉米秸稈和水稻秸稈可能是低成本優選有機物料，在高投入商業化種植地乙醇或生物乙醇可能是優選液體有機物質。尤其在我國，秸稈資源豐富且易于獲取，將秸稈作為RSD 處理的碳源，變廢為寶，不僅減輕秸稈焚燒帶來的大氣污染，也提高農業廢棄物的資源利用率，在國內推廣具有重要意義。

本文介紹的碳源大部分取得了顯著滅菌效果，但是大部分處于室內試驗研究階段，在實際田間應用中，RSD 往往受土壤類型、病原菌類型和侵染程度等因素的影響，仍需要進一步開展研究。