霧化吸入布地奈德復合沙丁胺醇對單肺通氣致兔肺損傷的預防作用及機制探討

韓霜,何錕,張婧,張秀果,李建立,容俊芳

1 河北省人民醫院，石家莊050051；2石家莊市第四醫院

單肺通氣時機械剪切力、吸入高濃度氧以及萎陷側肺快速復張均可破壞血氣交換屏障，使細胞膜通透性增加，激活體內的炎癥信號通路，導致白細胞和各種促炎因子聚集，加重肺組織損傷。細胞外組蛋白是一種新發現的重要炎性介質，在感染、炎癥及免疫反應中發揮重要的作用[1]。研究[2]表明，術前霧化吸入布地奈德可有效改善肺通氣，減少單肺通氣時肺炎癥反應。沙丁胺醇為選擇性β2受體激動劑，可激動支氣管平滑肌的β2受體，擴張支氣管，增加纖毛清除功能，降低血管通透性，改善肺功能[3]。但布地奈德復合沙丁胺醇霧化吸入是否能減輕肺組織炎癥反應尚不明確。2012年10月～2013月10月，本研究觀察了預霧化吸入布地奈德及沙丁胺醇是否對單肺通氣致兔肺損傷有預防作用,并探討了其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器 健康雄性新西蘭大白兔24只，體質量2.5～3.0 kg，由河北醫科大學實驗動物中心提供。TNF-1α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒(加拿大YES公司)，細胞外組蛋白ELISA測定試劑盒(德國 Roche 公司)，硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液(深圳大佛藥業有限公司)，布地奈德混懸液(阿斯利康制藥有限公司，英國)。HX-200動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 布地奈德復合沙丁胺醇預霧化吸入方法及單肺通氣肺損傷兔模型的建立 采用隨機數字表法，將兔隨機分為A、B、C組，各8只。3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈麻醉后，行右側股動脈和左側股靜脈插管術。局部浸潤麻醉下行氣管切開，A組采用單腔氣管導管(ID 3.0 mm)置入氣管行雙肺通氣3 h。B、C組參照文獻[4,5]制備單肺通氣肺損傷模型，即采用自制雙腔氣管導管行左側單肺通氣2 h、雙肺通氣1 h。C組于單肺通氣前吸入沙丁胺醇0.15 mg/kg+布地奈德0.5 mg+生理鹽水共2 mL。A、B組均吸入等量生理鹽水。各組均采用容量通氣模式，通氣參數：VT 12 mL/K，FiO2100%，通氣頻率40次/min，I∶E為1∶2。

各組通氣結束后取右側肺下葉約1 cm×1 cm×2 cm肺組織，一部分用液氮凍存24 h后轉-80 ℃保存待測，另一部分用4 ℃多聚甲醛中固定肺組織常規石蠟包埋切片。取右側肺下葉行支氣管肺泡灌洗，生理鹽水5 mL,灌洗3次。支氣管肺泡灌洗液經單層紗布過濾靜置10 min 后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清-80 ℃凍存。

1.3 肺組織病理形態學觀察 采用HE染色，400倍光鏡下觀察肺組織病理學結果并行肺損傷程度評分。按照肺間質水腫、肺泡水腫、中性粒細胞浸潤和肺泡內充血評分：無改變或非常輕微為0分，輕度改變為1分，中度改變為2分，重度改變為3分，極重度改變為4分，累計4項指標的總分。每張切片隨機選擇10個高倍視野，進行10次評分，取平均值作為肺損傷評分。

1.4 肺濕/干質量(W/D)及肺通透指數(LPI)測算 取右側肺上葉稱濕質量(W)，置于80 ℃烘箱內干燥72 h至恒重，稱肺干質量(D)，計算肺W/D。LPI：取右肺下葉做肺泡灌洗，用5 mL生理鹽水分3 次進行灌洗，灌洗液回收量在80%以上，離心，留取上清液。取靜脈血標本離心留取血漿。采用ELISA法檢測灌洗液和血漿總蛋白(TP)。LPI=灌洗液TP/血清TP。

1.5 支氣管肺泡灌洗液TNF-1α、IL-6、IL-1β的測定 采用ELISA法按照試劑盒說明書步驟測定支氣管肺泡灌洗液中TNF-1α、IL-6及IL-1β。

1.6 血漿細胞外組蛋白測定 于霧化吸入前(T1)、通氣1 h(T2)、通氣2 h(T3)、通氣3 h(T4)采集靜脈血，分離血漿，采用 ELISA 法測定血漿細胞外組蛋白。

2 結果

2.1 三組肺組織肺損傷評分、W/D、LPI比較 與A組比較，B、C組肺損傷評分、W/D、LPI高(P<0．05);與B組比較，C組肺損傷評分、W/D及LPI低(P均<0．05),見表1。

表1 三組兔肺組織肺損傷評分

2.2 三組兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、IL-6濃度比較 與A組比較，B、C組兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、IL-6濃度升高 (P均<0．05)；與B組比較，C組兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、IL-6濃度下降 (P均<0．05)，見表2。

表2 各組兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、

2.3 三組各時點血漿細胞外組蛋白水平比較 與A組比較，B、C組各時間點血漿細胞外組蛋白水平升高(P均<0．05);與B組比較，C組各時間點血漿細胞外組蛋白水平降低(P均<0．05)，見表3。

表3 三組各時點血漿細胞外組蛋白水平

3 討論

單肺通氣期間細胞因子的相互激活和級聯反應是引起急性肺損傷的主要機制之一。與肺部炎癥有關的炎癥因子為 TNFα、IL-1β，IL-6、IL-8 及細胞黏附分子，且受NF-κB的調控。TNFα 是介導急性肺損傷的主要細胞因子，可誘導肺內皮細胞活化、白細胞遷移、粒細胞脫顆粒和毛細血管滲漏。故本研究測定肺泡灌洗液中TNF-1α、IL-1β及IL-6的濃度判定肺組織炎性反應程度。霧化吸入利用高速氧氣流形成液體霧，然后由呼吸道吸入以達到治療目的，具有用量少，起效快，不良反應少等優點，能有效治療呼吸道感染等疾病，因此本研究采用術前霧化吸入沙丁胺醇及布地奈德的給藥方式。本研究結果表明，與對照組相比其余各組肺損傷評分升高，肺組織W/D及LPI升高，且肺泡灌洗液中TNF-1α、IL-1β及IL-6濃度升高，提示長時間單肺通氣可導致肺組織水腫、通透性增加、炎癥反應，提示單肺通氣致兔肺損傷模型制備成功。

沙丁胺醇是一種短效 β2腎上腺素能受體激動劑，與氣道平滑肌細胞膜上的 β-受體具有良好的親和力，經氣道霧化吸入后形成直徑很小的氣溶膠顆粒，可達下呼吸道，藥物迅速彌散，直接作用于支氣管平滑肌，使平滑肌舒張，產生強大的支氣管擴張作用，從而改善肺功能，減輕肺組織缺氧性損傷，進而減輕缺氧引起的炎癥反應[6]。研究[7]表明沙丁胺醇可減輕膿毒癥大鼠的肺炎癥反應，改善肺功能。此外,沙丁胺醇還可以促進黏膜纖毛擺動，增加纖毛清除功能，降低血管通透性，抑制炎癥滲出，改善肺功能。布地奈德是一種高效的局部抗炎糖皮質激素，具有抗過敏、抗炎效果，其藥理作用是穩定內皮細胞和平滑肌細胞，抑制組胺釋放及支氣管收縮物質的釋放，緩解平滑肌的收縮。布地奈德氣管內治療可減輕鹽水灌洗模型導致的急性肺損傷，減輕炎癥反應，抑制肺上皮細胞凋亡，改善肺功能[8]。研究[9]表明，術前霧化吸入布地奈德可抑制開胸手術患者單肺通氣時的炎性反應，有助于改善肺功能。本研究結果表明，與B組相比，C組兔肺泡灌洗液TNF-1α、IL-1及IL-6的濃度下降，肺組織W/D及LPI下降，提示單肺通氣前吸入沙丁胺醇和布地奈德可減少TNF-1α、IL-1及IL-6等炎癥因子的釋放，從而減輕單肺通氣所致的肺組織炎癥反應，減輕肺組織水腫。

組蛋白是一組高度保守、堿性、帶正電荷的蛋白質。當細胞受到損傷或壞死時，染色質發生降解，釋放核小體入外周血，核小體再分解為組蛋白和DNA，少量組蛋白可迅速被單核巨噬細胞清除。但在嚴重損傷情況下，死亡細胞釋放大量組蛋白，超過了機體的清除能力，過剩的細胞外組蛋白便會作為內源性損傷相關分子啟動炎癥反應導致進一步的損傷[10，11]。研究[12]表明，細胞外組蛋白是急性肺損傷的重要效應因子。研究[13，14]發現，小鼠在創傷、注射脂多糖后，血漿中細胞外組蛋白水平明顯升高，提示細胞外組蛋白可能是ARDS病程發展的重要炎癥介質，由細胞外組蛋白引起的肺內皮激活可導致ARDS患者的中性粒細胞活化。研究[15]表明，細胞外組蛋白可促進塵肺患者肺纖維化。本研究結果表明，與對照組相比，其余各組各時間點血漿細胞外組蛋白表達升高，提示細胞外組蛋白參與了單肺通氣兔肺組織炎癥反應。有研究[16]表明，針對循環中組蛋白的治療可改善嚴重創傷后急性肺損傷患者的生存率。近期研究[17]表明，骨橋蛋白可減輕組蛋白引起的肺組織炎癥反應，且肝素可減少ARDS患者中細胞外組蛋白的釋放，因此通過抑制細胞外組蛋白的釋放可減輕其誘發的肺炎癥反應[18,19]。本研究結果顯示，與B組相比，C組各時間點血漿細胞外組蛋白水平下降，提示單肺通氣前吸入沙丁胺醇和布地奈德可通過降低血漿細胞外組蛋白水平而抑制肺組織炎癥反應，減輕肺組織損傷程度。

綜上所述，預霧化吸入布地奈德復合沙丁胺醇對單肺通氣致兔肺損傷有預防作用，且可能是通過降低支氣管肺泡炎性因子及血漿細胞外組蛋白水平而起作用的，至于細胞外組蛋白降低是否與布地奈德復合沙丁胺醇對單肺通氣致兔肺損傷預防作用的機制有關有待進一步研究探討。