不同培養(yǎng)條件對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌能力的影響

劉新宇 李大皓 李佩瑤

摘 要：目的：探究不同培養(yǎng)條件對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌能力的影響。方法：采用平板對峙培養(yǎng)法，以抑菌率為指標(biāo)，研究不同培養(yǎng)時間、碳源、培養(yǎng)基、pH值對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌能力的影響。結(jié)果：不同培養(yǎng)時間、碳源、培養(yǎng)基、pH值對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌的能力均有影響。培養(yǎng)到第4天時抑菌效果達(dá)到最佳，抑菌率為69.12%;不同碳源中，最優(yōu)為葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和乳糖;PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌的生長效果最佳;pH值為5～9時，哈茨木霉菌對串珠鐮刀菌抑制率無差異。結(jié)論：PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)到第4天達(dá)到最佳抑制效果，多種碳源及廣泛的pH值范圍均適合哈茨木霉菌對串珠鐮刀菌的生長形成抑制。

關(guān)鍵詞：哈茨木霉菌;串珠鐮刀菌;平板對峙培養(yǎng)法

Abstract： To investigate the effects of different culture conditions on the ability of Trichoderma harzianum to inhibit Fusarium moniliforme. The effect of different culture time， carbon source， culture medium and pH value on the ability of Rhizoctonia solani to inhibit the ability of Fusarium moniliforme was studied by using platelet confinement culture method and antibacterial rate as an index. Different culture time， carbon source， culture medium and pH value had an effect on the ability of Trichoderma harzianum to inhibit Fusarium moniliforme. The antibacterial effect was the best at the 4th day， and the antibacterial rate was 69.12%. Among the different carbon sources， best for glucose， maltose， mannitol and lactose; PDA culture medium is the best effect on Trichoderma harzianum to inhibit Fusarium moniliforme; pH value of 5 to 9 when Trichoderma harzianum on the inhibition rate of Fusarium moniliforme no difference.Conclusion： PDA culture medium reached the best inhibitory effect on the 4th day， and a variety of carbon sources and extensive pH range were suitable for the inhibition of the growth of Fusarium moniliforme.

Key words： Trichoderma harzianum; Fusarium moniliforme; Plate culture method

串珠鐮刀菌可引起植物莖腐、根腐[1]、穗腐[2]等癥狀，使植株生長不良，花梗易折斷，最終倒伏。在玉米生長過程中，由多種病原菌單獨(dú)或復(fù)合侵染造成根系和莖基腐爛的莖基腐病，俗稱根腐病，是玉米產(chǎn)區(qū)一類重大病害。不同年代、不同地區(qū)，該病害的發(fā)病率略有不同，一般年份發(fā)病率在10%～20%，嚴(yán)重年份高達(dá)80%～90%，產(chǎn)量受損，嚴(yán)重者甚至顆粒無收[3-4]。一旦發(fā)生莖基腐病，玉米果穗與籽粒均受到危害，被侵染的果穗局部或全部被霉層覆蓋，霉層呈現(xiàn)粉褐色、紅色、灰黑色及黃綠色。發(fā)病植株的果穗失去光澤，顆粒不夠飽滿或癟空腐爛等。該病主要由多種鐮刀菌、腐霉菌侵染引起，其中鐮刀菌主要之一為串珠鐮刀菌[5]。另外，由串珠鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生的串珠鐮刀菌素是一種水溶性毒素，其性質(zhì)穩(wěn)定，在pH值為4～10時，高溫100℃加熱及低溫冷凍干燥均不會被破壞[6]。該毒素不僅對植物有危害，對動物亦有很大的危害作用。串珠鐮刀菌素主要作用于動物心肌、肝、軟骨細(xì)胞、骨骼肌和脾等增殖比較活躍的細(xì)胞，從而干擾細(xì)胞分裂增值，抑制細(xì)胞蛋白合成，影響各種酶活性及生物膜的通透性，降低機(jī)體免疫功能[7]。

生物防治和化學(xué)防治都是植物病害防治的重要手段。但由于化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，造成了嚴(yán)重的大氣、水體和土壤污染，并通過食物鏈累積循環(huán)進(jìn)入到人體，危害人類健康;同時，化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，不僅導(dǎo)致部分病菌、害蟲產(chǎn)生了很強(qiáng)的抗藥性，而且許多病菌害蟲的天敵也被大量殺死，致使一些病菌、害蟲的發(fā)生更加嚴(yán)重[8]。而利用生物防治抵御病蟲害，就能有效地避免上述負(fù)面影響，具有廣闊的應(yīng)用前景。木霉菌作為一種生長繁殖速度快，適應(yīng)性很強(qiáng)，廣泛存在于世界各地土壤中的生防菌，利用其生命力旺盛、適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快的特點(diǎn)，與病原菌競爭空間和營養(yǎng)，從而達(dá)到抑菌作用[9]。木霉菌作為國際公認(rèn)的一種重要的生防菌，對大多數(shù)病原菌有抑菌作用，并且資源豐富，生產(chǎn)成本低。在國內(nèi)外利用木霉菌做成的制劑，對多種病原菌均具有優(yōu)良的防治效果[10-11]?；诖耍趯?shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件下，筆者探究了不同培養(yǎng)條件對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌能力的影響，以期為實(shí)際開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌 哈茨木霉菌本實(shí)驗(yàn)室提供，串珠鐮刀菌由農(nóng)學(xué)院提供。

1.1.2 試劑 葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、蔗糖、瓊脂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乳糖、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、氯化鈉、氯化鈣、硝酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉，本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器 DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺、SPX-400生化培養(yǎng)箱、SPX-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器、LQ-C100001電子天平、C21-RK2106電磁爐、微波爐、BCD-190TMPK冰箱、便攜筆式pH分析儀。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及其制備 （1）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮洗凈，切成邊長約為1cm的塊狀，200g，加水煮沸20～30min至軟化，雙層紗布過濾，取濾液加入葡萄糖20g、瓊脂20g，煮沸待瓊脂熔化，定容1000mL。（2）胡蘿卜煎汁瓊脂培養(yǎng)基：制作方法與PDA培養(yǎng)基相同，僅將馬鈴薯換為胡蘿卜。（3）稻草與麩皮培養(yǎng)基[12]：稻草剪成小段，80g，麩皮10g，煮沸20min，雙層紗布過濾，取其濾液加CaCl2 0.3g、KH2PO4 2g、（NH4）2SO4 1.4g、MgSO4·7H2O 0.3g、瓊脂20g，煮沸待瓊脂熔化，定容1000mL。（4）Czapek培養(yǎng)基：蔗糖30g、FeSO4·7H2O 0.01g、KCl 0.5g、NaNO32g、MgSO4·7H2O 0.5g，瓊脂20g，煮沸待瓊脂熔化，定容1000mL。以上培養(yǎng)基pH值自然，均在121℃滅菌20min。

1.2.2 菌種的活化 取3℃保藏的哈茨木霉菌與串珠鐮刀菌于PDA平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)4d，作為供試菌種備用。

1.2.3 平板對峙試驗(yàn)法 菌種活化后，用7mm打孔器分別在菌落邊緣打取哈茨木霉菌與串珠鐮刀菌，再用接種環(huán)挑取菌落接種于同一個PDA培養(yǎng)基的平板（平板外徑9cm，內(nèi)徑8.8cm），兩者相距（4±0.3）cm，作為處理組;然后取另一個PDA培養(yǎng)基的平板于中間僅接種串珠鐮刀菌作為對照組，每組進(jìn)行3個平行。30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于第1、2、3、4、5、6天觀察測量對照組和處理組的串珠鐮刀菌半徑。對照組測量方法：以接種點(diǎn)為頂點(diǎn)，任意測量2條形成直角的菌落半徑，取其平均值;處理組測定方法：測量哈茨木霉菌及串珠鐮刀菌2個接種點(diǎn)連線上的串珠鐮刀菌的菌落半徑。抑菌率，計算公式如下：

抑菌率（%）=（對照組半徑-處理組半徑）/對照組半徑×100

1.3 數(shù)據(jù)處理 用SPSS和Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時間哈茨木霉菌對串珠鐮刀菌對峙試驗(yàn)結(jié)果 在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，在PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行哈茨木霉菌與串珠鐮刀菌的對峙試驗(yàn)，分別計算第2、3、4、5、6天的抑菌率，方法參照1.2.3。用目力估測法[13]觀察處理組中哈茨木霉菌的生長情況。測量記錄2～6d處理組中2個菌落連線中串珠鐮刀菌的平均半徑。從圖1可以看出，培養(yǎng)到第2天時，哈茨木霉菌與串珠鐮刀菌菌絲生長開始接觸，并未出現(xiàn)抑制效果;隨著時間的延長，哈茨木霉菌和對照組中串珠鐮刀菌的生長半徑均呈增大的趨勢，對照組的串珠鐮刀菌在培養(yǎng)的第6天長滿培養(yǎng)皿，處理組的哈茨木霉菌與串珠鐮刀菌在培養(yǎng)第4天時半徑均呈不增加的趨勢。

不同培養(yǎng)時間哈茨木霉菌對珠鐮刀菌的抑菌率見表1。由表1可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，哈茨木霉菌對串珠鐮刀菌的抑制率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。培養(yǎng)到第2天時，哈茨木霉菌與串珠鐮刀菌菌絲剛接觸，并未出現(xiàn)抑制效果。培養(yǎng)到第6天時，哈茨木霉菌對串珠鐮刀菌的抑菌率顯著高于2～4d的處理，與培養(yǎng)5d的處理無差異。而由圖1可知，培養(yǎng)4d時，處理組的哈茨木霉菌與串珠鐮刀菌均已不再生長，5～6d時的抑菌率的提高是由于對照組的串珠鐮刀菌的菌落半徑繼續(xù)增加造成的。故后續(xù)試驗(yàn)以培養(yǎng)4d的抑菌率為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 不同碳源處理對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長的影響 在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，分別用等量的淀粉、蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖替代PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖，進(jìn)行哈茨木霉菌與串珠鐮刀菌對峙試驗(yàn)，于第4天計算抑菌率，方法參照1.2.3。用目力估測法觀察處理組中哈茨木霉菌的生長情況。由圖2可知，葡萄糖、麥芽糖、甘露醇及乳糖對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長能力的影響無差異。葡萄糖、麥芽糖處理顯著高于蔗糖處理。甘露醇、蔗糖、乳糖及可溶性淀粉對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長的能力影響無差異?？梢姡诠┰囂荚粗?，葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和乳糖的處理抑菌率較高。這與林志偉等[14]研究結(jié)論，黃綠木霉菌在液體培養(yǎng)過程中，結(jié)構(gòu)單一的碳源更有利于有效抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生不同。

2.3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長的影響 在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，分別在PDA培養(yǎng)基，胡蘿卜煎汁瓊脂培養(yǎng)基，稻草粉與麩皮培養(yǎng)基，Czapek培養(yǎng)基進(jìn)行哈茨木霉菌與串珠鐮刀菌對峙試驗(yàn)，于96h計算抑菌率，方法參照1.2.3。用目力估測法觀察處理組中木霉菌的生長情況。由圖3可知，供試的4種不同培養(yǎng)基中，PDA培養(yǎng)基的處理的抑菌率顯著高于Czapek、稻草與麩皮和胡蘿卜煎汁培養(yǎng)基。稻草與麩皮和胡蘿卜煎汁培養(yǎng)基對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長的能力影響無差異，但均顯著高于Czapek培養(yǎng)基的處理。目力觀察明顯可見，在Czapek培養(yǎng)基中無論哈茨木霉菌還是串珠鐮刀菌的生長速率均受到影響，而且木霉菌更加明顯，長勢微弱，但是依然對串珠鐮刀菌有抑制作用。2個菌種在此培養(yǎng)基中生長不夠旺盛的原因有待進(jìn)一步研究。

2.4 不同pH值對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長的影響 在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，在未加入瓊脂的PDA培養(yǎng)基，用10mol/L的HCI和NaOH把其pH值分別調(diào)至4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，再加入瓊脂煮沸待其熔化，進(jìn)行木霉菌與串珠鐮刀菌的對峙試驗(yàn)，于96h計算抑菌率，方法參照1.2.3。用目力估測法觀察對照組串珠鐮刀菌和處理組木霉菌的生長情況。由圖4可知，pH值為7、8時抑菌率最高，兩者間處理對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長能力的影響無差異，但該處理顯著高于pH值為4.5、10.0。當(dāng)pH值為4.5、6.0、9.0、10.0時，對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長能力的影響無差異。當(dāng)pH為5.0～9.0時，哈茨木霉菌對串珠鐮刀菌的抑菌率無差異，也印證了哈茨木霉菌作為生防菌適應(yīng)能力強(qiáng)，生命力旺盛的特點(diǎn)。當(dāng)pH值為4.5、5.0較低時，串珠鐮刀菌菌落生長較慢，并且目力觀測可以看出，菌落生長厚薄與密度均較弱。

3 討論

近年來，由于化學(xué)農(nóng)藥污染嚴(yán)重，人們環(huán)保意識的提高，對生物防治的研究與關(guān)注越來越多。木霉菌作為國際公認(rèn)的優(yōu)秀生防菌，其本身和代謝產(chǎn)物均得到了各國學(xué)者青睞。根據(jù)研究報告，不同方法、不同的木霉菌或其代謝產(chǎn)物對不同的病原菌抑制效果具有很大區(qū)別。孫冬梅等[12]研究表明，黃綠木霉菌代謝產(chǎn)物在50%濃度下對楊樹爛皮病菌的抑制效果達(dá)到100%。侯巨梅等[15]用平板對峙培養(yǎng)法研究表明，當(dāng)培養(yǎng)到第3天時，棘孢木霉菌天Q1對串珠鐮刀菌的抑菌率達(dá)到57.14%。

本試驗(yàn)采用平板對峙試驗(yàn)法，在PDA培養(yǎng)基中隨著時間延長抑菌率增大。從理論上來說，如果有足夠的生存空間和營養(yǎng)充足，處理組中的哈茨木霉菌利用其快速生長的優(yōu)勢能夠從四周包圍串珠鐮刀菌，而對照組中的串珠鐮刀菌則會無限長大，因此抑菌率將無限接近于100%。但在一定條件下得出來的試驗(yàn)結(jié)果存在一定的局限性。本試驗(yàn)特定的條件下培養(yǎng)1～6d中，第6天抑菌率高達(dá)76.13%，但是結(jié)合處理組中兩菌相對面串珠鐮刀菌的半徑來看，當(dāng)培養(yǎng)到第4天時已經(jīng)出現(xiàn)了最好的抑菌效果。不同的碳源對對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長的能力影響差異顯著。在試驗(yàn)的6種不同碳源中，葡萄糖作為碳源時抑菌率最高，但葡萄糖與麥芽糖、甘露醇、乳糖4者處理差異不顯著。不同的培養(yǎng)基對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長的能力影差異顯著，最好的為PDA培養(yǎng)基抑菌率高達(dá)69.12%，而最差的Czapek培養(yǎng)基才22.09%。這可能是因?yàn)镃zapek培養(yǎng)基碳源（蔗糖）單一，營養(yǎng)物質(zhì)不夠豐富造成的。同時，如Czapek培養(yǎng)基這些采用已知化學(xué)成分的有機(jī)化合物、無機(jī)化合物和生長因素等作為營養(yǎng)物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基總稱為合成培養(yǎng)基，一般都會添加多種微量元素，價格昂貴且配置麻煩，不適用于現(xiàn)實(shí)大量使用。由本試驗(yàn)結(jié)果表明，在pH值為5.0～9.0時，對哈茨木霉菌抑制串珠鐮刀菌生長影響的差異不顯著，它們在較大pH值跨度中均能生存，性質(zhì)穩(wěn)定。因此，在配置培養(yǎng)基時一般取pH值自然即可。

根據(jù)每次相同培養(yǎng)基重復(fù)中3次平行處理來看，處理組中兩菌接種點(diǎn)距離遠(yuǎn)近對抑菌率也存在很大影響。在其他條件相同的情況下，隨著距離的增大，抑菌率反而減小。近距離造成兩菌對生存空間及營養(yǎng)物質(zhì)競爭更激烈。

5 結(jié)論

哈茨木霉菌能抑制串珠鐮刀菌的生長，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)到第4天達(dá)到最佳的抑制效果，多種碳源及廣泛的pH值范圍均適合哈茨木霉菌對串珠鐮刀菌的生長形成抑制。

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（責(zé)編：張宏民）