穿心蓮水提取物對(duì)大腸桿菌臨床分離株的體外抑制試驗(yàn)

唐豪 郭慧琳

摘 要：試驗(yàn)用不同濃度的穿心蓮水提取物對(duì)大腸桿菌臨床分離株進(jìn)行了體外抑制試驗(yàn)。制備含不同濃度穿心蓮的培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)，其中試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組、試驗(yàn)Ⅳ組和試驗(yàn)Ⅴ組培養(yǎng)基分別含不同濃度的穿心蓮，試驗(yàn)Ⅰ組的培養(yǎng)基不加藥作為對(duì)照。3 d后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和回歸分析。結(jié)果表明，穿心蓮對(duì)大腸桿菌具有抑制作用。各組之間均存在顯著差異（P<0.05）。其中試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅳ組、試驗(yàn)Ⅴ組之間，試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅴ組之間，試驗(yàn)Ⅲ組與試驗(yàn)Ⅴ組之間均差異極顯著（P<0.01）。劑量與抑制率之間的回歸方程為：y=1.672 9x+2.778 6，R2=0.992，其半數(shù)效應(yīng)濃度EC50=21.28 mg/mL。

關(guān)鍵詞：穿心蓮;大腸桿菌;體外抑制試驗(yàn)

穿心蓮[Andrographis paniculata （Burm. f.）Nees]又名春蓮秋柳、一見喜、欖核蓮、苦膽草、金香草、金耳鉤、印度草和苦草等，一年生草本，藥用植物，具有解熱、抗炎、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。在臨床上，穿心蓮主要用于治療人或動(dòng)物的腸道感染、呼吸道感染、皮膚疾病以及急性菌痢、胃腸炎、感冒發(fā)熱和高血壓等疾病;另外，穿心蓮也可用于抗癌和抗生育等[4-10]。研究表明，穿心蓮具有很高的體外抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、甲型鏈球菌和乙型鏈球菌均有明顯的抑菌作用[7]。為進(jìn)一步確定穿心蓮對(duì)致病性大腸桿菌的抑制作用，特進(jìn)行本試驗(yàn)。

1? 材料與方法

1.1 材料

藥物：中藥穿心蓮購(gòu)自本地醫(yī)藥公司。

菌株：雞大腸桿菌菌株系本實(shí)驗(yàn)室從當(dāng)?shù)仉u場(chǎng)疑似病例中分離、鑒定和保存的優(yōu)勢(shì)菌株O78型大腸桿菌。

培養(yǎng)基的制備：普通LB肉湯和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制。

1.2 方法

1.2.1 穿心蓮水提取物制備

稱取穿心蓮200 g，清洗、浸泡后加? 2 000 mL蒸餾水，文火煎煮1 h，保存濾液。分別加1 600 mL和800 mL蒸餾水進(jìn)行第2次和第3次煎煮。合并3次濾液，加熱濃縮到200 mL（生藥濃度為 1 g/mL），高壓滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 制備菌懸液

將大腸桿菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，? ?37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)菌液濃度為107 CFU/mL。

1.2.3 含藥培養(yǎng)基的制備

按常規(guī)方法配制普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，按所需濃度加入不同體積的穿心蓮水提取物，使各組培養(yǎng)基藥物濃度分別為5 mg/mL、? ? 10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL，高壓滅菌后，放置于超凈工作臺(tái)，待培養(yǎng)基冷卻至40 ℃～50 ℃，倒入培養(yǎng)皿。

1.2.4 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)設(shè)5組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)（n=3）。試驗(yàn)Ⅰ組的培養(yǎng)基不含穿心蓮水提取物，為空白對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組、試驗(yàn)Ⅳ組和試驗(yàn)Ⅴ組的培養(yǎng)基分別加入不同體積的穿心蓮水提取物，使各組培養(yǎng)基含藥濃度分別為5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL。

1.2.5 預(yù)試驗(yàn)

取1 mL菌懸液，用無(wú)菌生理鹽水104倍稀釋，然后取100 μL稀釋菌液，均勻涂布于事先準(zhǔn)備好的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，置4 ℃冰箱備用。

1.2.6 抑菌試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下，取預(yù)試驗(yàn)制備的大腸桿菌培養(yǎng)皿，選擇一生長(zhǎng)良好、邊緣整齊且獨(dú)立的圓形菌落，用直徑5 mm的打孔器進(jìn)行打孔，用鑷子輕輕夾出菌餅并翻轉(zhuǎn)，使長(zhǎng)有菌落的一面朝下，對(duì)各試驗(yàn)組及對(duì)照組的培養(yǎng)皿進(jìn)行接種，每組3個(gè)。接種后置于? ?37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后用十字交叉法測(cè)量每組3個(gè)菌落直徑，求平均值，并計(jì)算抑制率。抑制率計(jì)算公式如下：

2? 結(jié)果與分析

穿心蓮水提取物對(duì)大腸桿菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

由表2可見，F(xiàn)=52.36>F0.01，說(shuō)明該試驗(yàn)的處理平均數(shù)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異（P<0.01）。用最小顯著差數(shù)法（LSD法）進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表3。

查t值表，當(dāng)dfe=10時(shí)，t0.05=2.228，t0.01=3.169。計(jì)算得：

由表3可見，試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅳ組和試驗(yàn)Ⅴ組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異（P<0.01），與試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異（P<0.05）。試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅴ組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異（P<0.01），與試驗(yàn)Ⅲ組和試驗(yàn)Ⅳ組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異（P<0.05）。試驗(yàn)Ⅲ組與試驗(yàn)Ⅴ組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異? ? ? （P<0.01），與Ⅳ組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異（P<0.05）。

不同濃度藥物對(duì)大腸桿菌的抑制率見表4。

由表4可見，穿心蓮水提取物對(duì)大腸桿菌的抑制效果較好。培養(yǎng)3 d時(shí)，藥液濃度為5 mg/mL時(shí)的抑制率僅為14.95%;隨著藥液濃度的逐步增加，抑制率也隨之增加;當(dāng)藥液濃度達(dá)40 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)65.71%。

對(duì)抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，以其藥液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率概率值為縱坐標(biāo)，得出穿心蓮對(duì)大腸桿菌抑制率的回歸曲線（圖1），其回歸方程為：

3? 討論

中藥穿心蓮植株的不同部位所含的活性成分不盡相同。穿心蓮葉中的穿心蓮甲素（去氧穿心蓮內(nèi)酯）、穿心蓮乙素（穿心蓮內(nèi)酯）和穿心蓮丙素（新穿心蓮內(nèi)酯）的含量分別為0.1%以上、1.5%以上和0.2%以上，還含有高穿心蓮內(nèi)酯、潘尼內(nèi)酯、穿心蓮?fù)?、穿心蓮?fù)?、穿心蓮甾醇和?谷甾醇-D-葡萄糖甙等成分。穿心蓮的根除含穿心蓮內(nèi)酯外，還含5-羥基-7，8，2'，3'-四甲氧基黃酮、5-羥基-7，8，2'-三甲氧基黃酮、5，2'-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮、芹菜素-7，4'-二甲醚和α-谷甾醇等成分。穿心蓮的整棵植株含14-去氧-11-氧化穿心蓮內(nèi)酯和14-去氧-11，12-二去氫穿心蓮內(nèi)酯;另?yè)?jù)初步分析，穿心蓮還含甾醇皂甙、糖類及縮合鞣質(zhì)等酚類物質(zhì)。

在人醫(yī)上，炎琥寧注射液和喜炎平注射液的主要成分均來(lái)自中藥穿心蓮，其中炎琥寧注射液的主要成分是14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯-3，19-二琥珀酸半酯鉀鈉鹽一水物，喜炎平注射液是由穿心蓮內(nèi)酯磺化物制成的中藥注射劑。這提示穿心蓮抗炎的有效成分是穿心蓮內(nèi)酯及其洐生物。據(jù)相關(guān)資料報(bào)道，炎琥寧注射液對(duì)急性咽炎有較好的治療作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)和抑制咽部病理改變的發(fā)生有關(guān)。喜炎平注射液的主要成分是穿心蓮內(nèi)酯總酯磺化物，對(duì)感染性疾病特別是肺炎有治療作用，作用機(jī)制為通過(guò)抑制炎性因子的釋放使抗炎因子與促炎因子趨向平衡，從而達(dá)到合理的抗炎作用。利用像喜炎平注射液這類具有清熱解毒作用的中藥治療感染性疾病時(shí)，并不在于中藥能殺死多少種細(xì)菌或病毒，其更為重要的作用是阻斷感染后的炎癥反應(yīng)，對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。也就是說(shuō)，中藥是在綜合效應(yīng)之下，達(dá)到與抗菌藥物相同的治療目的。在本次試驗(yàn)中，穿心蓮對(duì)大腸桿菌具有明顯的抑制效果，其機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。