三株未知菌的鑒定和藥物敏感性試驗

陳 建 派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500

豬瘟疫苗生產的原料就是大兔，所以對挑選原料兔有嚴格的規定。在生產豬瘟疫苗時，也有明確規定，采取的脾臟和淋巴必須保證無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染 （參照中華人民共和國獸藥典3306、3307和3308）。抗生素是治療大兔疾病不可缺少的藥物，但是抗生素的濫用很容易使細菌產生抗藥性。近年來，為了促進大兔的生長發育，抗生素作為飼料添加劑已經得到普遍應用，抗生素在預防和治療細菌性感染上效果明顯，但大兔不是所有的抗生素都能使用的。生產實踐證明，在養兔生產中濫用抗生素是不可取的。抗生素可以破壞兔盲腸內正常的微生物菌落，影響消化，甚至可導致疾病。原因是抗生素有個致命的問題，就是抗生素通常會將腸道內的有益菌一起“通殺”，這不但會破環腸道內菌群的平衡、使有害菌伺機大量繁殖而產生致命毒素外，還有可能令正常的菌群數量減少或消失，這可能比任何疾病都來得嚴重，因為兔主要是依賴盲腸中微生物（有益菌）的分解來消化食物，也就是說，吃進去的食物先由腸道中種類繁多的微生物（有益菌）分解之后，大兔才可吸收，殺死了這部分細菌，無異于直接殺死兔子。在疫情發生時，不僅需要而且應該及時使用抗生素進行預防和治療，這都是無可非議的。在實際生產中，很多養殖場(戶)濫用抗生素的情況非常普遍，不僅沒有起到防病治病的作用，反而導致了各種問題的發生，如死胎、流產、中毒、營養不良等。

某兔場大兔出現腹瀉、身體消瘦，死亡率很高。分別采集腹瀉的、身體消瘦的大兔及不給小兔喂乳（且腹瀉）的母兔脾臟和淋巴樣品進行無菌檢驗，檢出3株未知細菌，樣品編號分別為P1102、L1103和L1104。為了鑒定3株未知菌，采用平板培養法、液體培養法、PCR鑒定法和藥物敏感性試驗進行細菌菌種鑒定及耐藥試驗。結果判定樣品P1102為葡萄球菌，L1103與L1104為大腸桿菌，現報道如下。

表1 采樣及檢驗情況

表2 引物序列

1 材料和方法

1.1 樣品來源 在無菌條件下分別采集腹瀉的、身體消瘦的大兔及不給小兔喂乳（且腹瀉）的母兔脾臟和淋巴樣品，搗碎，進行無菌檢驗，見表1。取其中長有未知細菌的血斜樣品P1102、長有未知細菌的硫乙醇樣品L1103和L1104（均源自2018年4月某兔場）作進一步試驗。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、LB培養基、藥敏紙片，購自北京陸橋技術股份有限公司；2×EasyTaqTM PCR SuperMix、DL2000 DNA Marker，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 引物 參考Weisburg W G等[1]文獻報道的未知細菌的16S擴增引物序列（見表2），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 細菌分離及純化培養 分別挑取樣品P1102號血斜內菌落，吸取少量L1103與L1104液體接于TSA平板、劃線，置37℃恒溫箱培養12 h，次日，挑取單菌落繼續接于TSA平板、劃線，置37℃恒溫箱培養12 h。分別挑選樣品均勻一致的數個菌落接種于LB培養基，37℃靜置培養24 h，觀察細菌的生長情況。

1.5 PCR擴增 PCR反應體系為50 μL：分別加入2×EasyTaqTM PCR SuperMix 250 μL，菌液 1 μL，兩對 引 物 （FD1+RD1）與 （FD1+RP2）各 1 μL，ddH2O 24 μL。反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 60 s，30個循環；最后72℃延伸10 min。以雙蒸水為空白對照，將擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統進行觀察。將陽性樣品送鉑尚生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.6 藥敏試驗 藥敏試驗按常規K-B法進行[2]，挑取分離培養的單個典型菌落于LB培養液中培養16 h，取適當稀釋菌液均勻涂布在瓊脂平板上，平板置室溫下干燥3～5 min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，置37℃恒溫箱內8～12 h后觀察結果，判斷標準參照CLSIM100-S20[3]。

2 結 果

圖1 3株菌平板培養菌落形態

2.1 細菌分離結果 從分離菌落的形態上可以發現，P1102的菌落為白色原點；L1103與L1104的菌落形態比較接近，都為半透明狀（見圖1）。

2.2 PCR擴增結果 用FD1+RD1對引物進行PCR擴增，可以看到P1102、L1103、L1104都出現約1 500 bp的條帶。采用FD1+RP2對引物進行PCR擴增，未出現陽性條帶（見圖2-圖3）。

圖2 FD1+RD1 PCR結果

2.3 測序比對結果 經過測序，將樣品P1102、L1103和L1104的序列在NCBI進行BLAST比對，結果P1102與登錄號為MG460585（葡萄球菌CAU 1472株）的序列同源性為100%；L1103與登錄號為CP009104（大腸桿菌菌RM 9387株）的序列同源性為100%；L1104與登錄號為CP023349（大腸桿菌菌Ecol 2264株）的序列同源性為100%[4-8]。判定樣品P1102為葡萄球菌，L1003與L1004為大腸桿菌[9]。

圖3 FD1+RP2 PCR結果

2.4 藥敏試驗 藥敏試驗結果見圖4、表3。

P1102株敏感的藥物有11種：阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、諾氟沙星、青霉素、利福平、多西環素、新霉素、左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星；中介的藥物有3種：丁胺卡那、環丙沙星和大觀霉素；耐受的藥物有9種：多粘菌素B、復方新諾明、紅霉素、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素和四環素。

圖4 藥敏紙片平板抑菌情況

L1103株敏感的藥物有3種：左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星；中介的藥物有2種：多粘菌素B和大觀霉素；耐受的藥物有18種：阿莫西林、氨芐西林、丁胺卡那、復方新諾明、氟苯尼考、諾氟沙星、青霉素、紅霉素、環丙沙星、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、利福平、鏈霉素、多西環素、慶大霉素、四環素和新霉素。

L1104株敏感的藥物有6種：多粘菌素B、諾氟沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星；中介的藥物有2種：丁胺卡那和大觀霉素；耐受的藥物有15種：阿莫西林、氨芐西林、復方新諾明、氟苯尼考、青霉素、紅霉素、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、利福平、鏈霉素、多西環素、慶大霉素、四環素和新霉素[10-11]。

表3 3株分離菌藥敏試驗結果

3 討 論

本次試驗鑒定了一株葡萄球菌（P1102）、兩株大腸桿菌（L1103和L1104），3株分離菌均呈現多重耐藥性。隨著養殖業的發展，抗生素的濫用現象越來越普遍，造成細菌耐藥性也越來越強。結果是使用常規藥物無法控制病情，造成巨大的經濟損失。從藥物敏感試驗結果表明，分離菌P1102對阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考等11種藥物敏感，對多粘菌素B、復方新諾明、紅霉素等9種藥物耐受。分離菌L1103僅對左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星3種藥物敏感，對阿莫西林、氨芐西林、丁胺卡那等18種藥物耐受。分離菌L1104敏感的藥物有6種，分別為多粘菌素B、諾氟沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星；耐受的藥物多達15種，分別為阿莫西林、氨芐西林、復方新諾明、氟苯尼考、青霉素、紅霉素、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、利福平、鏈霉素、多西環素、慶大霉素、四環素和新霉素。

取樣的母兔未患乳房炎，但小兔出現腹瀉，母兔脾臟搗碎后檢測含有葡萄球菌。小兔腹瀉、不給小兔喂乳，通常是由于母兔患有乳房炎，但抗生素的濫用可能導致母兔沒有患乳房炎但小兔喝奶后直接引起腹瀉。由此可見，抗生素的規范使用必須得到重視，懷疑發生細菌性感染時，應根據藥敏試驗結果和國家相關規定合理用藥。