PK15細胞在不同培養條件下的生長情況

張小蘭 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

PK15細胞為豬腎上皮細胞，父母代源自1955年美國Stice提供的成年豬腎細胞PK-2a，被ATCC 收藏（CCL-33）[1]。PK15 細胞對豬圓環病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒等多種病毒比較敏感，已廣泛應用于獸用疫苗的研究和生產[2]。隨著疫苗工藝研發的不斷創新，生物反應器因有其自身的優勢如可以穩定控制培養條件、高密度培養、規模化生產等被廣泛應用于生產領域。然而，一般種子的擴增也需要從方瓶培養、轉瓶培養再到反應器培養的過程。本文探討了PK15細胞在方瓶、轉瓶、生物反應器培養條件下的細胞生長情況，為制定優化的培養策略奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和培養基

1.1.1 細胞 PK15細胞株，由大北農集團北京動物醫學研究中心提供。

1.2.1 培養基 MEM購自gibco公司。

1.2 細胞培養

1.2.1 方瓶培養 復蘇一支PK15細胞至T75方瓶中培養，傳3代至細胞密度穩定后，按細胞最佳傳代比例分種至3個T75方瓶中培養。待培養72 h，細胞剛好長滿單層且狀態良好時，3瓶T75方瓶細胞分別按正常方式消化傳代，即棄去細胞培養液，用37℃預熱處理的PBS清洗細胞2遍，每遍25 mL，再用0.25%胰酶4 mL消化細胞，待細胞出現圓縮分離時棄去消化液，加6 mL含5%血清的營養液終止消化并進行吹打細胞。每瓶細胞消化后分別取1 mL細胞懸液至EP管中待計數，其余細胞懸液按比例1：15分種至T75方瓶中繼續培養，培養液總量為25 mL，5%CO2、37 ℃培養。 每隔 24 h、48 h、72 h 觀察每瓶細胞狀態并記錄結果。每瓶細胞連續消化傳代3次，每次傳代比例為1：15，每次取消化后的細胞懸液計數，收集每次的細胞分種密度、培養72 h細胞密度、細胞增長倍數和觀察細胞24 h、48 h、72 h的生長狀態。

1.2.2 轉瓶培養 同上述方瓶培養，來自同一支復蘇細胞，逐漸按一定的比例擴增至15 L轉瓶培養，待轉瓶培養2代密度穩定后，按最佳分種密度分種至3個15 L轉瓶中培養。待培養72 h細胞長滿致密單層且狀態良好時，3瓶細胞分別按正常方式消化傳代，即棄去細胞培養液，用37℃預熱處理的PBS清洗細胞2遍，每遍200 mL，再用 0.25%胰酶100 mL消化細胞，待細胞出現霧層時棄去消化液，加500 mL含5%血清的營養液終止消化。每瓶細胞消化后分別取1 mL細胞懸液至EP管中待計數，其余細胞懸液按比例1：8分種至15 L細胞瓶中進行培養，培養液總量為1 500 mL，培養條件為12 r/min、37℃溫室。 每隔 24 h、48 h、72 h觀察細胞狀態并記錄結果。每瓶細胞連續消化傳代3次，每次傳代比例為1：8，每次取消化后的細胞懸液計數，收集每次的細胞分種密度、培養72 h細胞密度、細胞增長倍數和觀察細胞24 h、48 h、72 h的生長狀態。

1.2.3 生物反應器培養 同上述方瓶、轉瓶培養，來源于同一支復蘇細胞，取培養72 h長滿單層且狀態良好的15 L轉瓶細胞2瓶，按正常方式消化傳代，收集細胞懸液并計數，以（5～6）×105個/mL接入反應器中培養，培養體積為2 000 mL，培養條件設置為pH 7.4、溶氧（DO）50%空氣飽和度、溫度37℃、轉速50 r/min。反應器最大培養體積為7 L，購自廣州齊志工程設備有限公司。培養過程中采用通過空氣、O2、CO2方式調控pH與溶氧，當pH與溶氧不能有效被控制時，采用添加7.5%NaHCO3進行調控。每隔24 h取樣計數并觀察細胞狀態。生物反應器按相同條件重復培養3次，每次收集細胞上罐密度，24 h、48 h、72 h的細胞密度、增長倍數和細胞狀態。

2 結 果

2.1 PK15細胞在方瓶中培養的生長情況 由表1可見，采用方瓶培養細胞，當分種密度在 （1～5）×104個/mL時，經過72 h培養，細胞密度均能增值到（0.5～1.5）×106個/mL， 增長 10～30 倍，24 h、48 h、72 h的細胞狀態都良好。

2.2 PK15細胞在轉瓶中培養的生長情況 由表2可見，15 L轉瓶培養細胞， 當分種密度在 （5～9）×104個/mL時，經過72 h培養，細胞密度均能增值到（0.5 ～1.0）×106個/mL，增長 5～10 倍，且細胞狀態均良好。

2.3 PK15細胞在生物反應器中培養的生長情況由表3可見，生物反應器培養PK15細胞，接種密度為（5～6）× 105個/mL，每隔 24 h 細胞能增長 2～3 倍，培養到72 h細胞能增長8～12倍，各時間段細胞狀態良好。

3 小結與討論

結果表明，PK15細胞在方瓶、轉瓶、生物反應器中培養均能很好生長，培養72 h細胞最高密度分別能達到 1.5 ×106個/mL、1 ×106個/mL、8 ×106個/mL，且細胞在每個時間段都處于良好狀態。三種培養體系中，細胞增長倍數最大的是方瓶，增長10～30倍；其次是生物反應器，增長8～12倍；最后是轉瓶，增長5～10倍。

表1 PK15細胞在方瓶中培養的生長情況

表2 PK15細胞在轉瓶中培養的生長情況

表3 PK15細胞在生物反應器中培養的生長情況

細胞體外培養環境中，pH是培養細胞的關鍵因素之一，它能影響細胞的粘附、存活與生長等功能。方瓶培養細胞可以通過5%CO2進行pH平衡調控，對于轉瓶顯然該方法行不通，而生物反應器是三種培養體系中最理想的培養系統。它不僅能穩定pH，還可以穩定溶氧、溫度、攪拌速度等，當營養不足時可以及時補充營養如葡萄糖等使細胞處于最佳環境狀態。因此，穩定的環境系統和營養物質的充分利用使反應器培養的密度達到更高。試驗結果中反應器培養密度最高能達到8×106個/mL也不足為奇。另外，方瓶培養是靜置培養，培養條件溫和，與生物反應器相比，細胞不受剪切力影響、液面的表面積大、溶氧基本可以滿足細胞要求[3]，試驗結果顯示方瓶培養細胞增長倍數最大，也許就是與這些因素密切相關。本試驗結果可以為生產制定PK15細胞的培養優化策略提供參考依據。