基于高通量測序的連栽木麻黃根際土壤細菌群落變化研究

周柳婷,李建鵑,趙艷琳,羅 揚,白 瑩,陳 軍,吳則焰,3,4,*,林文雄

1 福建農林大學生命科學學院,福州 350002 2 福建農林大學林學院,福州 350002 3 作物生態與分子生理學福建省高校重點實驗室,福州 350002 4 福建省農業生態過程與安全監控重點實驗室,福州 350002

木麻黃(CasuarinaequisetifoliaForst.)是木麻黃屬常綠喬木,20世紀50年代作為庭院綠化樹種引入我國[1- 2],因其良好的適應性及抗風、耐貧瘠、耐鹽堿等生理特點,在維持海岸帶生態系統穩定、緩解沿海沙地鹽堿危害、防潮汐侵蝕等方面都起到極其重要的作用[3]。目前濱海沙地的適生樹種較少,木麻黃作為重要的防護林樹種,長期受到嚴重的連栽障礙問題困擾[4],具體表現為木麻黃平均木生物量、林分生物量及林分凈生產力均呈現逐代下降趨勢,植株生長緩慢,病蟲害嚴重,造成產量、品質下降[5- 6]。如何緩解或消減木麻黃連栽障礙,成為國內外同行研究的前沿熱點。

前人研究認為,植物連栽障礙是地力衰退[7]、化感物質自毒作用[8- 9]、土壤微生態環境失衡等諸多方面綜合作用的結果。在地力衰退研究方面,有學者指出長期連栽條件下植物對土壤礦質營養元素的片面吸收,使連栽土壤養分不均衡,進而導致林分生產力下降、森林防護效益降低。更有甚者試圖通過增施肥料的措施來緩解連栽障礙但收效甚微,反而加劇了環境污染[10]。在化感物質自毒作用研究方面,李鍵[11]、鄧蘭桂[12]等人從木麻黃小枝提取物中分離鑒定出了黃酮類、鞣花酸類化感物質,認為自毒作用是引起木麻黃連栽障礙的原因。隨著研究的深入,國內外同行逐漸認識到化感物質釋放到土壤后勢必受到微生物的加工、分解、轉化等[10,13],其存在只是誘因而不是導致植物連栽障礙形成的直接因素[14],因此土壤微生態成為連栽障礙研究的關注焦點。深入研究“植物-土壤-微生物”三者在根際的互作過程,對于探索土壤微生物與植物生長發育之間的相互調控關系、揭示植物連栽障礙機制至關重要[15]。例如：Zhao等[16]研究表明,桉樹多代連栽后根際土壤中真菌多樣性增加；Wu等[17]發現連栽杉木使根際土壤中真菌/細菌比例顯著增加,且微生物群落多樣性和代謝活性顯著降低,從而打破了土壤微生態平衡；葉功富等[18]研究發現,連栽木麻黃林地中細菌、放線菌、固氮菌與纖維素分解菌數量分別比一代林地減少22.46%、12.25%、32.66%和29.61%,真菌數量增加22.39%,微生物總量減少21.07%。目前,雖然已有少量關于連栽木麻黃土壤微生物數量變化的研究,但由于傳統微生物培養方法的局限性,未能充分揭示連栽條件下土壤微生物群落結構及多樣性的變化規律[19]。本研究利用空間代替時間的方法,采用高通量測序技術擴增細菌的16S rRNA基因高變區,并對物種進行注釋及相對豐度分析,探索連栽木麻黃根際土壤細菌群落變化規律,為揭示木麻黃連栽障礙機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗樣地選址于福建惠安赤湖國有防護林場(118°55′E,24°35′N),該林場占地面積約433 hm2,地處中國南亞熱帶氣候區。該地區夏季多臺風和暴雨,秋冬季盛行東北風。年均溫19.8℃,極端低溫1℃,極端高溫35℃,年降雨量1029 mm,年蒸發量2000 mm[20]。該林場栽植有3個不同代數的木麻黃人工林,其中第一代木麻黃林(First rotation plantation,FCP)栽植于1987年,第二代(Second rotation plantation,SCP)栽植于2011年,第三代(Third rotation plantation,TCP)栽植于2014年。不同樣地的伴生樹種和林下植被基本一致,伴生樹種均為少量的臺灣欒樹(Koelreuteriaelegans)和潺槁木姜子(Litseaglutinosa(Lour.)C. B. Rob.),林下植被均為霍香薊(AgeratumconyzoidesL.)和鬼針草(BidenspilosaL.)。土壤質地均為風積黃沙土。

1.2 土壤樣品的采集

2018年7月,于福建惠安赤湖境內的國有防護林場內設置樣地：在FCP、SCP和TCP設立3個林地概況相近的20 m×20 m實驗樣地,每個樣地設3個重復樣方,共9個樣方。采集木麻黃根際土壤方法參考王圳等[21]的“抖落法”：沿“S”形路徑在每個樣方內選擇20株平均胸徑、樹高相近的木麻黃,去除其落葉層后逐層挖去上層覆土,剪下細根分枝并輕輕抖動,仍粘在細根上的即為根際土壤,用小毛刷收集至自封袋中保存備用。將每個樣方內取得的20份根際土壤混勻為1份土樣,共獲得9份土壤樣品。土樣通過2 mm篩選后其中一部分保存于-80℃冰箱,另一部分土樣4℃冰箱保存用于測定土壤中微生物多樣性。

1.3 根際土壤DNA提取及PCR擴增

利用試劑盒BioFast Soil Genomic DNA Extraction Kit(BioFlux公司,中國)提取木麻黃根際土壤微生物基因組總DNA。DNA濃度通過Nanodrop進行測定,并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質量。再將基因組總DNA用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板,采用 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶(New England Biolabs公司,美國)對細菌16S rRNA基因的V4區域進行擴增。擴增引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)[22]。采用50 μL PCR擴增體系,反應程序為：98℃預變性1 min；30個循環包括(98℃,10 sec；50℃,30 sec；72℃,30 sec)；72℃,5 min。擴增后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的質量。將PCR產物送至北京諾禾至源科技有限公司進行高通量測序。

1.4 數據分析

測序所得的原始數據經Fast QC軟件進行質控后,利用Cutadapt(V1.9.1)軟件去除短序列(<200 bp)及低質量序列(q<25)[23]。通過Mothur方法與SILVA數據庫對97%相似度的有效序列分配操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTUs)[24]。依據物種分類信息繪制物種分類條形圖和物種豐度熱圖[25]。再通過QI-IME 軟件計算樣品的覆蓋度和多樣性指標[26- 28]。運用PICRUSt軟件對菌群的功能和代謝途徑進行預測分析[29]。

2 結果與分析

2.1 連栽木麻黃根際土壤細菌群落OTU組成及結構

通過IonS5TMXL測序平臺,從3個林地概況相近的不同連栽代數木麻黃根際土壤中總共得到338560條有效序列,平均每個樣品的有效序列為37618條。以97%的序列相似性閾值將有效序列聚類為17627個OTU。其中FCP均值為1905個OTU,SCP均值為2046個OTU,TCP均值為1924個OTU。平均而言,約98.6%的有效序列可聚類為門級,但僅有38.68%以上的有效序列可聚類為屬級。稀釋曲線可直接反映所抽取的優化序列深度是否合理,并間接反映樣品中的物種豐富度[30]。由圖1可知,抽取的序列條數達到25000條以上,曲線趨于平坦,表明不同處理土壤所測的序列庫容都能夠較好地反映細菌群落種類數量,測序數據量基本合理。

Venn圖可以直觀地體現不同代數木麻黃根際土壤細菌群落OTU組成的差異性及重疊情況(圖2)。維恩分析結果表明,在OTU水平上,FCP中特異性細菌OTU占總OTU序列數的9.86%(341),SCP中特異性細菌OTU占14.68%(508),TCP中特異性細菌OTU占9.62%(333)。此外,FCP與SCP共有的OTU數量為292(8.44%),SCP與TCP共有的OTU數量為345(9.97%),FCP與TCP共有的OTU數量為177(5.12%)。FCP、SCP、TCP根際土壤中共有的細菌OTU數量為1464(42.31%)。

圖1 木麻黃根際土壤樣本微生物群落的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of microbial communities in rhizosphere soils samples of C. equisetifolia FCP：第一代First rotation plantation；SCP：第二代Second rotation plantation；TCP：第三代Third rotation plantation

圖2 基于OTU豐度的不同代數木麻黃根際土壤細菌群落維恩圖Fig.2 Venn diagram of bacterial communities in rhizosphere soil of different rotations of C. equisetifolia based on OTUs abundance

2.2 連栽木麻黃根際土壤細菌群落結構

2.2.1連栽木麻黃根際土壤細菌群落多樣性分析

通過土壤樣品中細菌群落多樣性分析指數,對連栽木麻黃根際土壤細菌群落物種豐富度和均勻度進行評估(cutoff=27075)。由表1可知,隨著連栽代數增加,Chao1指數、ACE指數均逐代下降,而Observed species、Shannon指數則呈現先上升后降低的趨勢,但差異均不顯著(P>0.05),Simpson指數幾乎沒有發生變化。Shannon指數分析顯示,木麻黃根際土壤SCP(8.874)中細菌多樣性相對較高,FCP(8.780)最低。從Chao1指數分析來看,FCP物種豐富度最高(2086.012),SCP次之(2005.244),TCP最低(2002.447)。

表1 連栽木麻黃根際土壤細菌群落豐富度和多樣性指數

每列不同字母表示差異達顯著水平(P≤0.05,n=3)

圖3 不同代數木麻黃根際土壤樣本間的Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac距離Fig.3 Weighted and unweighted Unifrac distances between rhizosphere soils samples of different rotations of C. equisetifolia

通過Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac距離來比較兩個樣品間物種多樣性的相異程度。FCP和SCP之間的Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac距離分別為0.181和0.416,FCP和TCP之間分別為0.174和0.405,SCP和TCP之間分別為0.123和0.391。

圖4 連栽木麻黃根際土壤細菌群落PcoA分析Fig.4 PcoA analysis of bacterial communities from rhizosphere soils of continuous rotations of C. equisetifolia

2.2.2連栽木麻黃根際土壤細菌群落PCoA分析與UPGMA聚類分析

基于OTU的木麻黃根際土壤細菌群落主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)結果見圖4,主成分1(PC1)與主成分2(PC2)分別解釋變量方差的30.32%、22.93%,兩者累計貢獻率達53.25%。PC1將FCP中的細菌群落與SCP、TCP明顯區分開,PC2將SCP中的細菌群落與FCP、TCP明顯區分開。UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)聚類分析結果見圖5,SCP和TCP的細菌群落結構聚集為一個群體,再與FCP聚集在一起形成系統發生樹,說明FCP與SCP、TCP二者存在較大差異。

2.2.3連栽木麻黃根際土壤細菌群落組成及結構變化

圖5 連栽木麻黃根際土壤的UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA analysis of bacterial communities from rhizosphere soil of continuous rotations of C. equisetifolia

在木麻黃根際土壤細菌群落中共檢測到10個門,優勢類群依次是變形菌門(Proteobacteria)(30.27%—34.42%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(28.10%—32.21%)、放線菌門(Actinobacteria)(14.86%—18.84%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(3.79%—8.09%)(圖6)。由表2可知,在屬水平上,熱酸菌屬(Acidothermus)、CandidatusSolibacter、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、根微菌屬(Rhizomicrobium)、酸桿菌屬(Acidibacter)、變桿菌屬(Variibacter)、布氏桿菌屬(Bryobacter)是根際土壤細菌群落的優勢屬(豐度>1%),其中FCP中最高豐度屬是熱酸菌屬(Acidothermus),而SCP、TCP根際土壤中CandidatusSolibacter相對豐度最高。隨著木麻黃連栽代數增加,根際土壤中熱酸菌屬(Acidothermus)、根微菌屬(Rhizomicrobium)、酸桿菌屬(Acidibacter)、布氏桿菌屬(Bryobacter)的相對豐度大體呈下降趨勢,其中酸桿菌屬(Acidibacter)的相對豐度在FCP、SCP、TCP之間的下降趨勢達顯著水平(P<0.05)。與之相反,慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)的相對豐度隨連栽代數的增加而增加。此外,從木麻黃根際土壤中前35個優勢細菌在屬水平的群落熱圖分析也可以看出,木麻黃連栽后土壤細菌群落組成結構發生了顯著變化(圖7)。

圖6 連栽木麻黃根際土壤優勢細菌在門水平的群落相對豐度Fig.6 The relative abundance of predominant bacteriain rhizospheric soil samples of continuous rotations of C. equisetifolia at the phylum level

3 結論與討論

植物根系與根際微生物形成的植物-微生物群落綜合體,是“植物-土壤-微生物”三者進行根際互作過程的重要場所[31]。根際微生物是土壤生態系統能量流動、物質循環和信息傳遞最主要的驅動者,對維持土壤生產力至關重要[32]。本研究通過高通量測序技術對連栽木麻黃根際土壤細菌群落變化進行探究。結果表明連栽后根際土壤細菌群落的組成與結構發生了顯著變化。由多樣性分析可知,木麻黃根際土壤細菌群落的Simpson、Chao1、ACE指數隨著連栽代數的增加而下降,Observed species、Shannon指數呈現先增加后減少的趨勢,變化趨勢不一致的原因可能是由于土壤理化性質不完全一致、林齡差異、森林凋落物等因素導致。這與韓亞飛[33]研究楊樹土壤細菌群落多樣性所提出的觀點相似,但與李延茂等[34]通過DGGE分析法研究杉木根際土壤細菌群落的結果不一致。推測可能是由于技術方法不同、樹種差異、地域差別、土壤異質性等因素造成研究結果不一致。

進一步分析連栽木麻黃根際土壤細菌群落組成與結構變化。由圖6可知,不同連栽代數木麻黃根際土壤細菌在門水平上的最優勢類群是變形菌門(Proteobacteria),分別占FCP、SCP、TCP根際土壤總細菌豐度的34.42%、30.27%、32.34%,證實了變形菌門是陸地土壤生態系統細菌群落的優勢類群,與Bazylinski等[35]的研究結果一致。慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)是變形菌門α變形菌綱的一種根瘤菌[36],可以與寄主植物形成共生關系,將大氣中的游離氮固定成寄主生物可以利用的形式,例如氨(NH3)或銨(NH4+)[37]。木麻黃是重要的結瘤共生固氮樹種之一[38],可以富集根瘤菌以適應貧瘠的濱海沙地環境。在本研究中,隨著連栽代數的增加,慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)的相對豐度隨之增加約132.57%、244.81%,且FCP、SCP兩者與TCP的差異達顯著水平(P<0.05)。與朱琳等[39]研究大豆連作土壤細菌群落多樣性所得的結論一致。與之相反,根際土壤中的熱酸菌屬(Acidothermus)、根微菌屬(Rhizomicrobium)、酸桿菌屬(Acidibacter)、布氏桿菌(Bryobacter)的相對豐度呈下降趨勢。變形菌門下的根微菌屬(Rhizomicrobium)是在土壤氮循環、解磷過程以及降解有機物過程中發揮重要作用的有益微生物[40]。在本研究中,隨著連栽代數的增加,根微菌屬(Rhizomicrobium)的相對豐度隨之降低約311.49%、282.16%,且FCP與SCP、TCP兩者的差異達顯著水平(P<0.05)。酸桿菌門下的酸桿菌屬(Acidibacter)是具有分解蛋白質和攝取環境周圍酸性物質的有益菌屬[41]。在本研究中,隨著連栽代數的增加,酸桿菌屬(Acidibacter)的相對豐度隨之降低約176.07%、284.54%,且FCP、SCP與TCP三者之間的差異達顯著水平(P<0.05)。由此可見,木麻黃連栽后根際土壤微生物群落結構發生了改變。這種現象可能是由于根系化感物質所產生的間接生態效應引起的,從而導致根際微生物發生惡化偏移。化感物質可以直接或間接影響根際微生物的代謝和生長發育,進而對根際微生物的種類、數量和分布產生影響[42]。如田給林[43]研究發現,外源添加阿魏酸能顯著促進草莓專化型尖孢鐮刀菌的生長及孢子萌發,從而間接侵染草莓植物,造成連作障礙的發生。劉金光等[44]研究發現,低濃度的苯甲酸對曲霉菌屬和鐮刀菌屬有顯著促進作用,造成根際土壤微生物群落結構失衡。

本研究證實了木麻黃長期單一化栽植后,根際土壤細菌群落結構發生了顯著變化,導致土壤微生態失衡,間接造成木麻黃連栽障礙問題。然而,連栽障礙形成及加重的原因不是單一孤立的,是眾多因素彼此影響、相互制約的結果。唯有建立在充分了解“土壤-微生物-根際”相互關系的基礎上,才能系統地認識連栽木麻黃的根際生態效應。因此,對于木麻黃根際土壤化感物質如何介導土壤微生物區系定向演變？以及關鍵的特異微生物如何在木麻黃連栽障礙形成的根際生態學中扮演重要角色,仍需實驗驗證討論。

圖7 連栽木麻黃根際土壤優勢細菌在屬水平的群落熱圖分析Fig.7 Heat map analysis of the main bacteria in rhizospheric soil of continuous rotations of C. equisetifolia at the genus level

表2 連栽木麻黃根際土壤在屬水平的細菌群落信息

Table 2 Information regarding the bacterial community at the genus level inrhizospheric soil ofC.equisetifoliaunder successive rotations

屬Genus相對豐度Relative abundance/%FCPSCPTCP熱酸菌屬Acidothermus5.2841a2.498b3.5629bCandidatus Solibacter3.7661a3.7932a3.9471a慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium1.6103b2.1348b3.9421a根微菌屬Rhizomicrobium3.4669a1.1130b1.2287b酸桿菌屬Acidibacter3.6959a2.0991b1.2989c變桿菌屬Variibacter3.6171a2.2727b3.4595ab布氏桿菌屬Bryobacter2.5793a1.5328b1.6707b伯克氏菌屬Burkholderia0.8815b1.3777a1.7593aH161.2533a0.7842b0.7707bTerracidiphilus0.7436b0.9037b1.2213a放線菌屬Actinospica0.1404b0.4481b0.8593a克洛氏菌屬Crossiella0.2425c0.4087b0.9701a地桿菌屬Geobacter0.2622b0.5134ab0.8199a分枝桿菌屬Mycobacterium0.4986b0.5368b0.8384a假羅布里斯屬Pseudolabrys0.3804ab0.5405a0.3053b鏈霉菌屬Streptomyces0.2278c0.474b0.6316a埃達布特屬Edaphobacter0.4666a0.0246b0.0320b乳桿菌屬Acidobacterium0.5392a0.0813b0.1305b苯基桿菌屬Phenylobacterium0.4555a0.1108b0.0874b酸雙酯屬Acidicaldus0.4925a0.3533b0.2979b梭菌屬Clostridium sensu stricto 10.3029b0.4112a0.3977abMizugakiibacter0.3817a0.0111b0.0037b

每列不同字母表示差異達顯著水平(P<0.05,n=3)