用單壁羥基碳納米管/殼聚糖內(nèi)涂層分析柱毛細管電泳法測定藥劑中的鹽酸金剛烷胺含量

王 榮，馬永鈞

(西北師范大學 化學化工學院， 甘肅省生物電化學與環(huán)境分析重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

鹽酸金剛烷胺( Amantadine Hydrochloride，AH)是一種人工合成的抗病毒類藥物[1]，主要用于治療帕金森病[2]、帕金森病異動癥[3]、小腦功能障礙[4]等神經(jīng)系統(tǒng)類疾病。同時它也被添加在各類感冒藥中用于預防、治療病毒性流感引起的呼吸道感染[5-6]。另外，鹽酸金剛烷胺與其它抗病毒類藥物共同使用還有治療丙型肝炎[7-9]的作用。但是，鹽酸金剛烷胺的用法或用量不當可能會引發(fā)暈厥、水腫、睡眠障礙[10-11]等不良反應，因此試樣中鹽酸金剛烷胺的含量測定對該藥品在臨床治療中的安全使用具有重要意義，同時也能為該藥品在日常生活中的合理應用提供依據(jù)[12]。

《中國藥典》中規(guī)定一般采用酸堿電位滴定法進行鹽酸金剛烷胺的含量測定[13]，該方法的操作較為復雜繁瑣，用于前處理的樣品取樣量大。此外，國內(nèi)外也有報道采用質(zhì)譜法[14]、色譜法[15-16]、高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器法[17-18]、高效液相色譜-示差折光檢測器法[19]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-21]等測定鹽酸金剛烷胺含量的儀器分析方法。通常對成分復雜的含鹽酸金剛烷胺的藥品試樣可采用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器法[17-18]、高效液相色譜-示差折光檢測器法[19]等來進行含量測定。雖然HPLC法具有靈敏度高、分離效能高等優(yōu)點，但設備昂貴，分析成本高，分析時間也較長。

目前，毛細管電泳-電致化學發(fā)光(CE-ECL)法因其分離高效、快速、低成本的優(yōu)勢，已在復雜藥物成分的分離測定中發(fā)揮出巨大作用[22-23]，但用此方法測定鹽酸金剛烷胺尚未見報道。因此，本文采用柱前N-甲基化衍生方法[24]，將鹽酸金剛烷胺轉(zhuǎn)化為具有強發(fā)光信號的單一衍生產(chǎn)物，并借助于一種新合成的MTS-gel凝膠電泳分離添加劑和一種單壁羥基碳納米粒子/殼聚糖復合物壁涂毛細管為分離柱，建立了柱前衍生CE-ECL法對實樣藥劑中鹽酸金剛烷胺進行含量測定的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型多參數(shù)分析測試系統(tǒng)(西安瑞邁電子科技有限公司,中國)；CHI760B型電化學工作站(上海辰華儀器公司,中國)；熔融石英毛細管(50 cm×75 μm i.d.河北永年光導纖維廠,中國)；pH-10型酸度計(賽多利斯有限公司,德國)；化學發(fā)光信號檢測采用三電極系統(tǒng)：工作電極采用含稀土類普魯士藍(Er-PBAs)修飾的鉑盤電極(Φ=0.3 mm)，修飾所用的試劑中僅將稀土離子Eu3+更換為Er3+后即可按原文獻方法進行制備[25]；輔助電極為鉑絲；參比電極為Ag/AgCl (1.0 mol/L KCl鹽橋)電極。

鹽酸金剛烷胺(AH,含量>98.0 %)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國)；肌氨酸(Sar,含量> 99.0 %),六水合二氯聯(lián)吡啶釕(含量>98.0 %)和殼聚糖(脫乙酰度>95 %)(百靈威科技有限公司，中國)；單壁羥基碳納米管(含量>90 %，平均粒度約1～2 nm)(北京德科島金科技有限公司，中國)；1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體(ImidBF4 IL，純度>99 %)，(蘭州中科凱特科工貿(mào)有限公司，中國)；D-(+)海藻糖二水合物(純度>99 %)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國);其余試劑均為分析純，實驗用水均為超純水(>18 MΩ·cm)。

1.2 電泳測定條件

MTS-gel的合成方法：在一只10 mL的比色管中加入10.0 mmol/L的硝酸鎂1.00 mL+20.0 mmol/L的海藻糖溶液0.50 mL+20.0 mmol/L的硅酸鈉溶液3.00 mL后用水定容，并置于32 ℃的水浴鍋中保溫反應13 min，取出后自然冷卻至室溫備用。

石英毛細管采用了殼聚糖/單壁羥基碳納米管做內(nèi)壁修飾材料，具體修飾步驟參見文獻[24]，所有制備環(huán)節(jié)中僅將含10.0 mg/mL的殼聚糖稀冰醋酸溶液(1.0 %,體積分數(shù))置換為含10.0 mg/mL殼聚糖+1.0 mg/mL單壁羥基碳納米管的稀冰醋酸溶液(1.0 %,體積分數(shù))，而保持其它制備條件完全一致，即可制備出符合分析要求的內(nèi)壁涂飾毛細管。

1.3 標準溶液和試樣溶液的配制與衍生反應步驟

用標準品試劑分別配制1.00 mmol/L鹽酸金剛烷胺溶液和1.00 mmol/L肌氨酸溶液儲備液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取片狀藥片精確稱取后研細成粉末置于50 mL小燒杯中，之后再加入2.0 mL無水乙醇，加水攪拌至充分溶解后全部轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中以水定容，自然放置達到自然沉降分層，定量吸取上層清液備用。膠囊狀藥品和沖劑類藥品可準確稱取其內(nèi)容物后直接置于50 mL小燒杯中，同樣采用以上方法充分溶解后定容于25 mL比色管中。所有預處理后的待測溶液應先加適量內(nèi)標物用于下步衍生反應。

在一只10 mL比色管中先加入1.00 mL 0.25 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH值=5.95),用移液管準確加入一定體積的混合標準溶液(含內(nèi)標物)或待測樣溶液(加入溶液的體積應不大于2.0 mL)，再加入1.00 mL 0.5 mol/L的甲醛溶液并用水稀釋到5.0 mL刻度處后于室溫下放置60 min；然后，在比色管中依次加入1.0 mL 0.20 mol/L的氫氧化鈉(用于調(diào)整反應液的酸度)和0.60 mL 0.01 mol/L的順丁烯二酸溶液，搖勻后放入57 ℃恒溫水浴中加熱反應50 min，取出冷卻至室溫；再逐次加入0.25 mL 0.1 mol/L醋酸銨，1.0 mL 0.25 mol/L硼氫化鈉(使用時臨時配制)以及0.50 mL 0.2 mol/L的硼酸溶液，注意這三種試劑的加入間隔時間相應保持為10 min,20 min和10 min。最后，直接以水定容至10.0 mL刻度處，取此溶液經(jīng)由濾膜過濾后就可進樣測定，也可于冰箱中保存至2周內(nèi)進行測定。

2 實驗結(jié)果

2.1 鹽酸金剛烷胺與肌氨酸衍生產(chǎn)物的電致化學發(fā)光響應特性

首先，采用CE-ECL法對鹽酸金剛烷胺和肌氨酸的混合標準溶液進行了衍生反應前后的對比試驗。如圖1所示，a曲線和b曲線分別表示100 μmol/L鹽酸金剛烷胺和25.0 μmol/L肌氨酸混合標準溶液衍生前后的電泳圖。由a曲線只能觀察到來源于肌氨酸的微弱雜質(zhì)峰，而沒有來源于鹽酸金剛烷胺的任何發(fā)光峰。然而，由b曲線可見有三個強的ECL電泳峰，經(jīng)過加標實驗反復確定得出1號峰屬于衍生反應中存留的甲醛試劑，而2、3號電泳峰則是待測物鹽酸金剛烷胺和內(nèi)標物肌氨酸各自的衍生產(chǎn)物。通過對比實驗曲線a、b就可以得出，經(jīng)N-甲基化衍生反應后的鹽酸金剛烷胺由不發(fā)光到產(chǎn)生了高達2500(a.u.)的強電化學發(fā)光信號峰，且發(fā)光衍生產(chǎn)物單一。

圖1 鹽酸金剛烷胺與肌氨酸混合標準溶液>經(jīng)衍生反應前后的對比電泳圖

Fig.1 Contrastive electropherograms of the AH and Sar mixture standard solution before and after the derivatization reaction.a.For the sample solution containing 100 μmol/L AH and 25.0 μmol/L Sar，b.For the same sample solution to be undergone through a pre-column N-methylation derivatization process

2.2 柱前衍生反應關鍵實驗條件的優(yōu)化

一般而言，N-甲基化衍生反應主要分為三個步驟：α-伯胺基通過親核加成反應形成氨基醇中間體、氨基醇中間體脫水形成亞胺中間體、使用硼氫化鈉將亞胺中間體再還原具有更高ECL發(fā)光強度N-甲基化衍生產(chǎn)物[26]。因鹽酸金剛烷胺本身就含有鹽酸成分，樣品加入量較大時就會對影響衍生反應溶液的pH值，導致反應不徹底進而影響到衍生產(chǎn)物的ECL發(fā)光峰強度。因此，衍生反應過程中的所加入的NaOH量必須進行實驗優(yōu)化(參見實驗部分1.3)。從圖2中的結(jié)果可知，衍生反應中NaOH的加入量在0.16～0.2 mmol范圍內(nèi)時，標樣的ECL發(fā)光強度逐漸增大，當加入量超過0.2 mmol后，相應的發(fā)光強度值又有下降趨勢，此時的電泳峰也有展寬現(xiàn)象。因此，可確定NaOH的最佳加入量為0.2 mmol。

圖2 NaOH加入量對鹽酸金剛烷胺衍生物電泳峰強度的影響Fig.2 Effect of the addition amount of NaOH on the ECL peak intensity of AH derivative

2.3 背景電解質(zhì)中分離添加劑的優(yōu)化

圖3 MTS-gel凝膠添加劑濃度對鹽酸金剛烷胺和肌氨酸衍生物電泳峰分離程度的影響Fig.3 Effect of the additive dosage of MTS-gel on the separating degree of electrophoretic peaks of AH and Sar derivatives

2.4 測定鹽酸金剛烷胺的工作曲線

以一系列不同濃度的鹽酸金剛烷胺并各加入25.0 μmol/L的肌氨酸內(nèi)標物的混合標準溶液為測試液進行柱前衍生CE-ECL分析并紀錄其電泳圖。數(shù)據(jù)結(jié)果如圖4(a)和圖4(b)所示：由兩種衍生產(chǎn)物的電泳峰所得到的峰面積比AAH/ASar與鹽酸金剛烷胺的初始濃度在10～250 μmol/L和400～750 μmol/L之間有良好的線性關系，線性回歸方程分別為AAH/ASar=-0.1509 + 0.0942 CAH(μmol/L)(R2=0.9995)和AAH/ASar=-30.1729 + 0.1133 CAH(μmol/L)(R2=0.9991)，經(jīng)計算得出的檢測限為2.4 μmol/L(S/N=3)。此外，以含100 μmol/L鹽酸金剛烷胺+25.0 μmol/L肌氨酸的混合衍生樣平行進樣測定6次，經(jīng)統(tǒng)計得到鹽酸金剛烷胺和肌氨酸峰面積度值的標準偏差分別小于3.8%和2.1%，而相應電泳峰遷移時間的平均標準偏差值分別為3.1%和2.6%，表明本法的測定精密度良好。

圖4 鹽酸金剛烷胺原始濃度和鹽酸金剛烷胺衍生物與肌氨酸衍生物峰面積比值之間的定量關系Fig.4 Quantitative relationship curve between the ratio value of AAH/ASar and original concentration of AH

2.5 實際樣品測定

在最優(yōu)條件下，采用內(nèi)標法對市購的幾種成人及小兒感冒藥中的鹽酸金剛烷胺含量進行了定量測定，樣品的測定值、加標量和加標回收率結(jié)果如表1所示，由實樣回收率值表明本法的準確度尚令人滿意。通過與所測藥品金剛烷胺藥劑標識含量的對比可知，這幾種市售的感冒藥中鹽酸金剛烷胺含量均在標識值的91%～95% 范圍內(nèi)，符合國家藥品標準工作手冊及《中國藥典》中對藥品中鹽酸金剛烷胺含量的限度要求[27]。

表1 幾種實際樣品中鹽酸金剛烷胺含量的測定結(jié)果Table 1 Determination results of amantadine hydrochloride content in the several real samples

3 結(jié)論

本文選用單壁羥基碳納米管/殼聚糖修飾的毛細管柱，以MTS-gel為主要分離添加劑分析測定了幾種藥品中的金剛烷胺含量，成功建立了柱前衍生毛細管電泳-電致化學發(fā)光法測定藥品試樣中鹽酸金剛烷胺含量的一種分析方法。此外，實驗中使用的單壁羥基碳納米管/殼聚糖修飾的毛細管能提高分析結(jié)果的重現(xiàn)性，還證明了新合成的MTS-gel凝膠可作為電泳分離添加劑用于定量分析。該方法準確、快速，分析成本低，可完全適用于不同種類藥品中鹽酸金剛烷胺含量的檢測。