骨碎補總黃酮對去勢大鼠骨質疏松的防治作用

王永勝 胡菁菁 盧育南 鐘凱龍

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨組織微結構異常及骨骼脆性增加并容易發生骨折為基本特征的代謝性骨病[1]。當人體內的成骨或破骨細胞因發生數量和功能異常變化時，骨吸收和骨形成的動態平衡則會被打破[2]，引起骨組織生理代謝發生變化最終引起骨質疏松（osteoporosis，OP）。絕經后的骨質疏松癥是一種嚴重危害健康的代謝性骨病，主要歸咎于人體雌激素水平的降低[3]。當前骨質疏松的臨床治療方法較多[4]，中藥的治療尤其突出[5]。骨碎補總黃酮（rhizoma drynariae total flavones，RDTF）從骨碎補根莖中提取獲得，已有相關研究發現RDTF 對OP 防治作用及可能作用機制[6]。本實驗在成功制備去勢誘導的OP 動物模型基礎上，觀察RDTF 對卵巢去勢誘導骨質疏松模型大鼠的骨密度和組織形態學的影響。為今后進一步其機制研究提供有力支持。

1 藥品、動物及試劑材料與方法

1.1 一般材料

本研究起止時間為2018 年10 月—2020 年1 月，選擇3 月齡斯普拉格道利（sprague dawley，SD）大鼠50只，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，雌性大鼠，體質量（180±16）g，購于上海克萊勒實驗動物中心。強骨膠囊（有效成分0.142 g，批號：181101，北京歧黃制藥有限公司）。包埋機（BMJ-A，常州中威電子儀器），顯微鏡（BA210T，Motic）， DXA（Norland-XR36）。

1.2 研究方法

隨機分三組：Sham 組、OP 組、RDTF 組（每組7 只）。予10%水合氯醛（CAS: 302-17-0，含量99.5%；規格：250 g；生產廠家：天津市科密歐化學試劑有限公司）0.3 mL/100 g 劑量深度麻醉，手術切除OP 組和給藥組大鼠雙側卵巢，假手術（Sham-operated，Sham）組只切除腹腔中少量軟組織和脂肪。術后飼養3 個月后給藥干預，Sham 組和OP 組蒸餾水灌胃。RDTF 組按0.054 g/（kg·d）劑量灌胃。連續給藥3 個月。取材前禁食24 h，麻醉后手術暴露其股骨頭，用潔凈咬骨鉗將其鉗碎，用無菌eppendorf（EP）管收集并標記。

1.3 觀察指標

骨密度（bone mineral density，BMD）檢測，大鼠麻醉后，正位放置定位板，四肢伸展。應用DXA 采用小動物模式掃描，測量各組大鼠左側股骨BMD。

1.4 HE 染色

圖1 大鼠股骨BMD 掃描圖（左）；大鼠股骨組織切片（HE 染色，×100）（右）

大鼠股骨組織剪碎成約3 mm，4%多聚甲醛液（pH=7.4）4℃固定48 h。使用10%EDTA-2Na（PH =7.4）在4℃條件下脫鈣一個月，脫鈣液每周更換一次。脫鈣結束，石蠟包埋連續切片。切片的厚度約4 μm，置65℃的恒溫烘箱中烤6 h。將組織切片常規脫蠟染色制片。光鏡下觀察HE 染色情況。

1.5 統計學處理

采用 SPSS 17.0 軟件統計分析數據，計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨密度檢測

OP 組 大 鼠 股 骨BMD 值（0.366±0.033）mg/cm2顯 著 低 于Sham 組（0.465±0.008）mg/cm2（P ＜0.05），表明造模成功。RDTF 組骨密度（0.400±0.048）mg/cm2顯著高于OP 組。

2.2 大鼠股骨組織HE 染色

如圖1，Sham 組大鼠股骨組織形態結構較為完整，骨髓腔中央可見骨細胞，骨小梁粗細一致，無斷裂現象，骨小梁之間間隙較小且相互連接形成網絡結構。OP 組大鼠，骨組織形態結構不完整，骨小梁細小而松散，間距增大，骨小梁間連接點較少，分布稀疏且凌亂，游離末端增加，骨髓腔融合較嚴重，呈現出骨質疏松典型性病理形態學改變。與OP 組相比較，骨小梁數量增多，骨碎補總黃酮組大鼠股骨組織可見增厚的骨小梁，其連接點也增多。

3 討論

OP 是一種易于發生骨折的全身性骨骼病，其特征為骨的微觀結構退化、骨量減少、以及骨脆性增加、松質骨中骨小梁數量減少體積變小[7]。傳統醫學認為“腎主骨”，骨碎補味苦入腎經，具有補腎強骨、養傷止痛之功效，臨床上廣泛應用于腎虛腰痛、跌打骨傷[8]。骨碎補其主要成分有β-谷甾醇等黃酮類物質、PYD 等[9]。

本研究使用的有效成分RDTF，運用DXA 觀察其對OP 模型骨密度影響，結果顯示，RDTF 可顯著提高大鼠BMD。HE染色鏡下見OP 組股骨骨組織形態結構較不完整，骨小梁斷裂、丟失嚴重，骨小梁間連接點減少，游離末端變多，呈凌亂稀疏樣分布，間距擴大，骨髓腔嚴重融合，呈典型性骨質疏松病理形態學改變，提示造模成功。在持續給予RDTF 12 周后，該組骨小梁變厚，斷裂減少，連接點增多，排列趨規則，表明RDTF 可顯著改善OP[10]。目前骨轉換生化標志物如 BGP、BALP、PTH 等廣泛應用于臨床診療、研究中[11]，結合BMD，獲悉骨轉換動態，在評價抗骨質疏松的治療療效等方面具有重要作用[12]。

綜上所述，骨碎補總黃酮對去勢誘導的骨質疏松具有明顯的防治作用。但其相應地作用機制仍有待進一步研究。